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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性測定試劑盒

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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性測定試劑盒,PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸和磷酸氫離子,蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD +,在340nm測定NADH減少速率,從而計算PEPC活性。

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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性測定試劑盒

 Phosphorescent Carboxylase,分光光度法 50T/48樣)

一、測定原理

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸

和磷酸氫離子,蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH

生成蘋果酸和NAD +,在340nm測定NADH減少速率,從而計

PEPC活性。

二、自備儀器用品

臺式離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、移液

槍、研缽、冰和蒸餾水

三、試劑組成和配制

提取液:60mL×1 , 4保存

試劑一:30mL×1 瓶,4保存

試劑二:10mL×1 瓶,4保存

試劑三:粉劑×2支,-20保存,臨用前加4mL蒸餾水充分

溶解,現用現配。

試劑四:粉劑×1 支,-20保存,臨用前加5mL蒸餾水充分

溶解,用不完的分裝后-20保存(禁止反復凍融)。

試劑五:原液20μL×1 支,4保存

試劑五:稀釋液10mL×1 瓶,4保存

四、樣品前處理

1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心

后棄上清;按照細菌或細胞數量(10 4個):提取液體積

mL500-10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入

1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20

200W,超聲3s,間隔10 秒,重復30 次);在4°C

8000g離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10

比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰

浴勻漿。8000g4離心10min,取上清置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測

五、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min 以上,調節波長到340nm,用蒸

餾水調零。

2. 試劑五工作液的配置:將試劑五原液:試劑五稀釋液

=1:329稀釋,用多少配多少。

3. 將試劑一、二、三、四和試劑五工作液置于37°C(哺乳

動物)或25°C(其他物種)預熱5分鐘。

六、測定意義

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)廣泛存在于動物、植物、

微生物和培養細胞中,是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化

碳反應生成草酰乙酸不可逆反應的酶,對三羧酸循環的運

轉起重要調節作用。

七、PEPC活性計算

1 血清(漿)活力的計算

單位的定義:每mL 血清(漿)在每分鐘消耗1nmol NADH

定義為一個酶活力單位。

PEPC(U/mL) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷V÷T

=1624×A

2 組織、細菌或細胞中PFK活力計算

1)按組織蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH

定義為一個酶活力單位。

PEPC(U/mg) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷(Cpr×V)÷T

=1624×A÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為

一個酶活力單位。

PEPC(U/g) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷(W×V ÷V樣總)÷T

=1624×A÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol

NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC(U/10 4 cells) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷(500×V÷V樣總)÷T

=3.248×A

εNADH340nm 處摩爾吸光系數為6.22×10 3L/mol/cm

d :比色皿光徑(cm),1cm

V反總:反應體系總體(L),1010μL=1.01×10 -3L

10 91mol=1×10 9nmol

Cpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL

V:加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02mL

V樣總:加入提取液體積,1mL

T:催化反應時間(min),5min

W,樣本質量,(g)。

500 細菌或細胞總數,500萬。

 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性測定試劑盒

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