ATP 酶測定試劑盒(測普通組織勻漿) 生化試劑
- 型 號(hào):
- 參考價(jià):0~0
ATP 酶測定試劑盒(測普通組織勻漿),存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上,是生物膜上的一種蛋白酶,它在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要的作用。
ATP 酶測定試劑盒(測普通組織勻漿)
(貨號(hào):A016-2 不高速可測 Na +k +、Ca 2+Mg 2+、Ca 2+、Mg 2+-ATPase)
此試劑盒可測不需要高速離心的紅細(xì)胞膜以及不需要高速離心的組織勻漿中的 ATP 酶。
一、試劑組成與配制(50 管/48 樣 A016-2-1):
試劑一:液體 10mL×3 瓶,4℃保存 6 個(gè)月。
試劑二:液體 10mL×1 瓶,4℃保存 6 個(gè)月。
試劑三:液體 10mL×1 瓶,4℃保存 6 個(gè)月。
試劑四:粉劑×3 支,-20℃以下保存 6 個(gè)月。用時(shí)每支
加雙蒸水 5mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。余下的-20℃以下可
保存一周。
試劑五:粉劑×1 支,
4℃保存 6 個(gè)月。用時(shí)加雙蒸水 5mL,
適當(dāng)加熱溶解,4℃保存 3 個(gè)月。
試劑六:粉劑×1 支,4℃保存 6 個(gè)月。用時(shí)加雙蒸水
10mL[注 1],充分加熱使其溶解,室溫保
存。
試劑七:液體 10mL×2 瓶,室溫保存 6 個(gè)月。
試劑八:粉劑×3 瓶,
4℃保存 6 個(gè)月。用時(shí)每瓶加水 40mL
溶解。(溶解后避光 4℃可保存一周)。
試劑九:粉劑×1 瓶,4℃保存 6 個(gè)月。用時(shí)加水 100mL
溶解,室溫保存 3 個(gè)月。
試劑十:2.5mol/L 硫酸 100mL×1 瓶,室溫保存 6 個(gè)月。
試劑十一:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保
存 6 個(gè)月。0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:用
時(shí)將貯備液 20 倍稀釋,即取 0.5mL 加蒸餾水
定容至 10mL。
定磷劑的配制:按雙蒸水: 2.5mol/L 硫酸:試劑八:試劑九
=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃
色,若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,
定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
[注 1]:試劑六為過飽和溶液,所以在配制時(shí)最好用
90℃~100℃的熱蒸餾水 10.3mL(熱脹冷縮)邊
隔水加熱邊用玻璃棒攪拌,以使其充分溶解。
一次實(shí)驗(yàn)用不完再用時(shí)可能有結(jié)晶,用之前可
以再次邊隔水加熱邊玻璃棒攪拌使其溶解。
[注 2]: 配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,
也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
四、如果您的樣本很多可以采用簡便操作法:
測試前 A、B、C、D、E 五種混合試劑的配制:
根據(jù)規(guī)范操作表中 A、B、C、D、E 各管的試劑量
乘以您所需要測試的樣本數(shù)(n)再放寬 1~2 只的量(避
免吸到最后試劑量不夠),然后縱向混合。
六、測定意義:
ATP 酶存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上,是生物膜
上的一種蛋白酶,它在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳
遞方面具有重要的作用。
七、測定原理:
ATP 酶可分解 ATP 生成 ADP 及無機(jī)磷,測定無機(jī)磷的
量可判斷 ATP 酶活力的高低。
八、注意點(diǎn):
1、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測定所用試
管要求嚴(yán)格,要沒有一點(diǎn)磷,若試管放過磷酸或磷酸鹽
緩沖液,一定要洗得非常干凈,要先用洗潔精加水煮,
再用自來水沖,最后用蒸餾水沖干凈。最好用一次性塑
料管或新玻璃管,避免磷污染是檢測成敗的關(guān)鍵。
2、定磷劑配好后,不可放置太久,一般保存一天,最好現(xiàn)
用現(xiàn)配。隨時(shí)放冰箱。
3、最好采用先配 A、B、C、D、E 五種混合液中的幾種,
然后按簡化操作步驟進(jìn)行檢測。這樣快捷、準(zhǔn)確。
4、所有配試劑的器皿均要專用,包括吸硫酸的吸管及盛水
的器皿,最好用新的。
5、本研究所有加厚的一次性塑料試管供應(yīng),請(qǐng)?jiān)谟嗁徳噭?/span>
的同時(shí)訂購一次性塑料試管。
附錄Ⅰ:樣本前處理
一、樣本前處理:
1、全血的前處理:
①、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(詳見附錄Ⅱ)或血紅蛋白測定。兩者
只需測其中一樣。
②、洗滌紅細(xì)胞:取肝素抗凝全血 1mL,(若血樣較
少,則可以按一定比例減少血樣及各試劑的用
量。)加 4 倍左右的生理鹽水(0.86%NaCL 液),
輕輕混勻,
1000~1500 轉(zhuǎn)/分,離心 5~10 分鐘,
棄上清留沉淀的紅細(xì)胞。
③、制備溶血液:在上述沉淀的紅細(xì)胞中加入 1.5mL
雙蒸水,將試管放在旋渦混勻器上混勻 30 秒,
放置 15 分鐘。再混勻 30 秒,再放置 15 分鐘,
使其充分溶血,直至溶液透亮。糖尿病大鼠的
紅細(xì)胞是不可以冰凍,否則越凍越不溶血。
④、取溶血液按操作表進(jìn)行 ATP 酶檢測和血紅蛋白
測定。
2、組織的前處理:準(zhǔn)確稱取組織重量按重量(g):體積
(mL)=1:9 的比例加入 9 倍體積的生理鹽水,冰
水浴條件下,機(jī)械勻漿,制備成 10%的勻漿液,
2500 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘,取上清 0.2mL加 0.8mL
生理鹽水稀釋成 2%的勻漿待測。(取得的上清
液同時(shí)測一下相應(yīng)樣本的蛋白濃度,總蛋白測
定試劑盒,本所有售,推薦 A045-2,考馬斯亮
蘭法)
3、培養(yǎng)細(xì)胞的前處理:將培養(yǎng)細(xì)胞消化,離心,棄上
清,留下層細(xì)胞,用生理鹽水或勻漿介質(zhì)制備
成 10 7 /cm3的懸液,即 10 7 /mL 的懸液,再進(jìn)行
破碎。破碎細(xì)胞的方法有三種:①、用勻漿器
勻漿。(可以用勻漿機(jī),也可以用玻璃勻漿器手
工勻漿。)②、用進(jìn)口的超聲粉碎器粉碎。③、
反復(fù)凍溶 3 次。(第③種方法有時(shí)會(huì)影響酶活
力。)制備好的勻漿液不需要離心,在測試加樣
前要搖勻后取樣。(破碎好的勻漿液同時(shí)測一下
相應(yīng)樣本的蛋白濃度,總蛋白測定試劑盒,本
所有售,推薦 A045-4,BCA 法)
二、參考取樣量:
溶血液一般取 200μL,2%組織勻漿一般取 200μL,
細(xì)胞懸液一般取 200~300μL。如果您的樣本量很少,請(qǐng)
用超微量 ATP 酶檢測方法。
附錄Ⅱ:紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法
紅細(xì)胞計(jì)數(shù)有以下三種方法,只需取其中一種即可以。
(我所有制備好的曲線供您參考。)
1、計(jì)數(shù)板直接紅細(xì)胞計(jì)數(shù):
①、紅細(xì)胞稀釋液的配制:檸檬酸三鈉 3.8 克,甲醛 1mL,
蒸餾水 100mL,混勻,4℃保存。
②、取 1 支試管,加入紅細(xì)胞稀釋液 2mL,取抗凝全血
10µL 加入試管稀釋液中,反復(fù)吹吸數(shù)次,再將試管
顛倒數(shù)次混勻。
③、取一滴稀釋血液灌入計(jì)數(shù)板。(應(yīng)一次灌滿,而且不
要灌得太多。)
④、用高倍鏡計(jì)數(shù)左上、左下、右上、右下,中央 5 個(gè)中
方格的紅細(xì)胞數(shù),將數(shù)得的數(shù)字×10 10,即為每升血
中的紅細(xì)胞數(shù)。
2、光電比濁法計(jì)紅細(xì)胞數(shù):
取試管 1 支,加入上述紅細(xì)胞稀釋液 4mL,再取 20µL
抗凝全血,加入 4mL 稀釋液中,反復(fù)吹吸數(shù)次,再將試
管顛倒數(shù)次混勻,立即倒入比色杯中,于 540nm,1cm 光
徑,蒸餾水調(diào)零進(jìn)行比色,記下吸光度值。以計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)
的紅細(xì)胞的數(shù)值為橫坐標(biāo),以相應(yīng)管的吸光度值為縱坐
標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線。您可以不做曲線,用附錄Ⅲ的參考標(biāo)
準(zhǔn)曲線圖二(鼠紅細(xì)胞數(shù)與比濁法吸光度換算曲線)。根據(jù)
標(biāo)準(zhǔn)曲線查出紅細(xì)胞數(shù)。
3、用血紅蛋白(Hb)來換算紅細(xì)胞數(shù):
取 10µL 抗凝全血加入 2.5mL 血紅蛋白測試液中,混
勻,靜置 10 分鐘,于 540nm,1cm 光徑,蒸餾水調(diào)零進(jìn)
行比色。將測得的吸光度乘以 367.7 即為血紅蛋白的值。
以計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞的數(shù)值為橫坐標(biāo),以相應(yīng)管的血紅
蛋白數(shù)為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線。您可以不做曲線,用附錄
Ⅲ的參考標(biāo)準(zhǔn)曲線圖一(鼠紅細(xì)胞數(shù)與血紅蛋白數(shù)的換算
曲線)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出紅細(xì)胞數(shù)。
ATP 酶測定試劑盒(測普通組織勻漿)