NADH 氧化酶(NOX)測(cè)試盒

（貨號(hào)：A116-1-1 分光光度法）

一、測(cè)定意義：

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生

物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH 氧化

為NAD。該酶不僅參與NAD 的再生，而且與免疫反應(yīng)

密切相關(guān)。

二、測(cè)定原理：

NADH 氧化酶（NADH oxidase，NOX）能夠?qū)?/span>

NADH氧化為NAD，NADH 的氧化與2,6 二氯酚靛藍(lán)

（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍(lán)色的DCPIP 被還原為無色

的DCPIP，在600nm下測(cè)定藍(lán)色DCPIP的還原速率計(jì)算出

NADH 氧化酶活性的大小。

三、需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液

器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水

四、試劑的組成和配制( 50T/48 樣)：

試劑一：液體50mL×1 瓶，-20℃保存。

試劑二：液體10mL×1 瓶，-20℃保存。

試劑三：液體1mL×1 瓶，-20℃保存。

試劑四：液體50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑五：液體6 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑六：粉劑×2 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5mL

蒸餾水，用不完的試劑分裝后-20℃保存， 禁

止反復(fù)凍融。

五、樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①、準(zhǔn)確稱取0.1g 組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試

劑一和10μL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②、將勻漿600g，4℃離心5min。

③、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃

離心10min。

④、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從

線粒體泄漏的NOX（此步可選做）。

⑤、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200μL 試劑二和

2μL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，

超聲3s，間隔10 秒，重復(fù)30 次），用于NOX 活

性測(cè)定。血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

六、測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm，蒸

餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定：

（1）試劑四、試劑五和試劑六于37℃（哺乳動(dòng)物）或

25℃（其它物種）孵育5min。

（2）在1mL比色皿中加入40μL樣本、700μL試劑四、

100μL試劑五和160μL試劑六，混勻，記錄600nm 處20s

時(shí)吸光值A1和1min20s 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

七、NOX 活力單位的計(jì)算

1、血清（漿）NOX 活力的計(jì)算：

單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分

鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX 活力的計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：此法需要自行測(cè)定樣本

蛋白質(zhì)濃度。

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘

A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）

÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每g 組織在每mL 反應(yīng)體系中每分鐘A600

變化0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣

總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL 反應(yīng)體系

中每分鐘A600 變化0.01 定義為一個(gè)酶

活力單位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；

V樣：加入樣本體積，0.04mL；

V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；

W：樣本質(zhì)量；

500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

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