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免疫組化實(shí)驗(yàn)代測(cè),IHC實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

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免疫組化實(shí)驗(yàn)代測(cè),IHC實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù),免疫組化操作步驟
 

 一 免疫組化(LP 法)操作步驟

  1. 切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行

  ⒉ 緩沖液洗 3min/2 次。

  ⒊ 為了降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶造成的非特異性背景染色,將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。

  ⒋ 緩沖液洗 5min/2 次。

  ⒌ 滴加 Ultra V Block , 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。

  (注:孵育不要超過(guò) 10 分鐘,否則會(huì)導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 - 10% 正常羊血清,這一步可以省略。)

  ⒍ 緩沖液洗 5min/2 次。

  ⒎ 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小時(shí)。(具體孵育時(shí)間和溫度由試驗(yàn)者zui終決定)

  ⒏ 緩沖液洗 5min/2 次。

  9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增強(qiáng)子),在室溫下孵育 20 分鐘。

  10 .緩沖液洗 5min/2 次。

  11 .滴加 HRP Polymer(酶標(biāo)二抗) ,在室溫下孵育 30 分鐘。

  (注:HRP Polymer 對(duì)光敏感,應(yīng)避免不必要的光暴露并儲(chǔ)存在不透明的小瓶中。)

  12 .緩沖液洗 5min/2 次。

  13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen),混勻后滴加到切片上,孵育 3 - 15 分鐘。(具體時(shí)間由染色深淺決定。)

  14 .自來(lái)水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明,封片。

 

二.免疫組化主要步驟
1. 洗載玻片:將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時(shí)使一些肉眼看不見(jiàn)的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個(gè)小時(shí)左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中,將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys帶正電,而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷,從而產(chǎn)生吸附作用。
2. 包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟,先稍微冷卻,然后再將待包埋的組織置于石蠟之中,并排列整齊,再將塑料模具盒蓋上,zui后加入少許液體石蠟,進(jìn)行冷凍,使石蠟變成固態(tài)。
3.切片:將包埋好的組織從模具上取下來(lái),并置于石蠟切片機(jī)上,切片機(jī)通過(guò)調(diào)節(jié)上下左右來(lái)來(lái)使組織和切割方向*,然后調(diào)節(jié)切片的厚度,一般為5µm,如果比較難切,則可以適當(dāng)調(diào)整厚度,用毛筆將切割的載玻片向外拉,并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4. 撈組織:當(dāng)組織載玻片置于40°C溫水中之前,要先將水浴中的氣泡趕走,以免氣泡受熱上浮而貼到組織上,組織受熱展開(kāi),是組織不起皺紋,用載玻片撈組織時(shí),一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張,其中2-3張是備用的,每張載玻片上通常撈兩份組織,做對(duì)照使用,這樣形成的誤差就比較小了,而且撈載玻片的時(shí)候方向*,以便觀察,再將撈出來(lái)的載玻片置于架子上,放入37°C溫箱中烘干。
5. 脫蠟:依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個(gè)試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間,一般為12-15min.
6.抗原修復(fù):脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間,加入3%H2O2浸泡10min,從而除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3min(中火),一般剛到沸騰即可,冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫,蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來(lái)。
7.血清封閉:冷卻至室溫后,將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干組織周?chē)腜BS液,馬上加上血清,使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來(lái),然后放入37°C溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍(900µlPBS:100µl血清封閉液)。
8. 加一抗:將溫箱中的載玻片取出,用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周?chē)难澹右豢梗绻鰧?duì)照實(shí)驗(yàn),就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過(guò)一夜。
9. 加二抗:將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周?chē)腜BS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。
10. 加SABC:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周?chē)腜BS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍(990µlPBS:10µlSABC)。
11. 加顯色劑:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周?chē)腜BS后加上顯色劑。(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻,再加1滴顯色劑C,搖勻)

 A:DAB        B:H2O2        C:磷酸緩沖液
12. 復(fù)染:將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后,浸泡于蘇木精中染色,一般動(dòng)物組織為半分鐘,植物組織3-5min。
13. 脫水:將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后,依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min,zui后浸泡在二甲苯中,搬到通風(fēng)柜中。
14. 封片:用中性樹(shù)膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上,要先放平一側(cè),然后輕輕放下另一側(cè),以免產(chǎn)生氣泡,封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。

免疫組化實(shí)驗(yàn)代測(cè),IHC實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

三. 免疫組化染色步驟

  冰凍切片 4-8um ,室溫放置 30 分鐘后,入 4 ℃丙酮固定 10分鐘,PBS洗,5分鐘x3,用過(guò)氧化氫孵育5-10分鐘,消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。

免疫組化代測(cè),免疫組化實(shí)驗(yàn)代做,免疫組化操作步驟

四:如何實(shí)現(xiàn)*的免疫組化實(shí)驗(yàn) 
 
1 .固定 :用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片,甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好;但對(duì)于不同的組織和抗原 ,可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而的固定液,請(qǐng)于購(gòu)置前注意說(shuō)明書(shū)。
Bouin S固定液:飽和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng),固定較好,結(jié)構(gòu)完整,但因偏酸,對(duì)抗原 有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標(biāo)本的保存。 PLP液:即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。

2 .組織脫水,透明 :時(shí)間不能太長(zhǎng),否則在切片時(shí)容易碎片,切不完整。

3 .切片時(shí)展片: 有些組織在切片后難以在水中展開(kāi),這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?br />
4 .烤片: 60℃ 30分鐘或37℃ 過(guò)夜,溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng),抗原 容易丟失。

5 .蠟塊及切片的保存: 在4℃保存

6 .脫片問(wèn)題 : Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化 染色工作中zui常用的一種防脫片劑,6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液,適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行,可用雙重處理(APES和Poly-L-Lysine)的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下,可用如下方法:切片在脫蠟前,放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分鐘,晾干,即可進(jìn)行下一步。

7 .滅活內(nèi)源性酶: HRP系統(tǒng):3%雙氧水滅活;AP系統(tǒng):3%HAc滅活。

8 .暴露抗原 : 對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí),必須采用高溫加熱抗原修復(fù),這將有助于暴露抗原決定簇,從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說(shuō)明書(shū))。對(duì)于不同的組織,不同的抗原,不同的抗體,所采用的方法應(yīng)不一樣,可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9 .封閉: 在山羊血清封閉,非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí),可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉

10 .抗體稀釋: 應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則,對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。

11 .背景高: 在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下,如果背景依舊高,可采用含1‰ Tween20的PBS洗,特別是在顯色之前要多洗。

12 .返藍(lán): 在蘇木素復(fù)染后,可用堿性緩沖液(如PBS)或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。

13 .顯色: 一定要在顯微鏡下觀察,注意控制背景。
14. 在整個(gè)操作過(guò)程中,切片千萬(wàn)不能干燥,否則會(huì)有非特異性染色。

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