上海信帆提供免疫組化實驗代測服務
更新時間：2018-08-15 點擊次數：1430次上海信帆提供免疫組化實驗代測服務
免疫組化實驗代測
免疫組化，是應用免疫學基本原理一抗原抗體反映，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反映使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術（immunohistochemistry）或免疫細胞化學技術（immunocytochemistry）。
服務說明
冰凍切片免疫組化實驗步驟
1、 冰凍切片固定：冰凍切片室溫晾干，置于冷丙酮固定10min，于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
2、 抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH9.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中低火10-15min，斷電間隔10min轉至中低火10-15min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定）
3、 阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育25min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
4、 BSA或者血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。（一抗是山羊來源用10%正常兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）
5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）
6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加組化試劑盒內與一抗相應種屬的二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50min。
7、 DAB顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。
8、 復染細胞核：Harris蘇木素復染3min左右，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。
9、 脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --無水乙醇Ⅰ6min -無水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。
免疫組化實驗代測
石蠟切片免疫組化實驗步驟
1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。
2、 抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH9.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，中火8min至沸，停火8min保溫再轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
3、 阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液（雙氧水：純水=1:9），室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
4、 BSA或者血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。（一抗是山羊來源用10%正常兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）
5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）
6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50min。
7、 DAB顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。
8、 復染細胞核：Harris蘇木素復染3min左右，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。
9、 脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --無水乙醇Ⅰ6min -無水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。
10、 顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。
幾種常用的免疫組織化學方法的原理
免疫熒光細胞化學技術
將已知抗體標上熒光素,以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原,在熒光顯微鏡下觀察.當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后會發出一定波長的熒光,從而可以確定組織中的抗原定位或定量.
免疫酶細胞化學
是目前免疫組織化學研究中zui常用的技術.基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞或組織內的相應抗原進行定位或定性研究.
免疫膠體金技術
就是用膠體金標記一抗，二抗或其他的能特異性的結合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，對組織或細胞內的抗原進行定性，定位或定量研究.由于膠體金的電子密度高，多用于免疫電鏡的單標記或多標記的定位研究.
免疫組織化學的全過程包括：①抗原的提取與純化;③免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化;③將顯色劑與抗體結合形成標記抗體;④標本的制備;③免疫細胞化學反應以及呈色反應;⑧觀察結果。
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二、免疫組織化學基本技術
1.材料
免疫組織化學可用于多種材料.如實驗動物,人體組織,細胞和體外培養細胞都可用于免疫組化研究.
一.)實驗動物 種類很多，以狗，兔，大鼠和小鼠zui為常用.關鍵是取材迅速，大小適宜，固定充分.
二.)人體材料 包括活檢和手術切除的標本，以及通過各種手段收集的細胞都可用于免疫組化研究.如 脫落細胞 穿刺涂片 骨髓涂片 血涂片等.
三.)體外培養的細胞標本 根據所培養細胞的生物學特性采用不同的方法.對于貼壁生長的細胞可采用在培養瓶或培養皿底部放置載玻片，讓細胞在其上面生長，到時將載玻片取出進行固定，染色.懸浮生長的細胞可采用離心涂片或離心后細胞團塊固定，脫水，包埋，切片的方法進行免疫組織化學研究。
2 .固定
固定的目的在于保持組織的形態和結構的完整，盡量保存組織中的抗原，使其不被破壞或擴散，以減少非特異性染色或假陽性，假陰性的結果.
選擇固定方法的原則是:
在保持組織形態的完好和被檢測抗原的前提下,盡量應用濃度zui低的固定劑及zui短的固定時間.
常用固定劑
一.)醛類固定劑 起作用是使組織之間相互交聯,將抗原保存在原位.此類固定劑的特點是對組織的穿透力強,組織收縮性小.常用的有甲醛,多聚甲醛和戊二醛.可單用也可聯合使用.
(1)3% 中性甲醛固定液液:
配制: 30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml
特點: 滲透性好,能完好地保護組織結構和某些抗原.由于交 聯作用會影響細胞膜的通透性,會遮蔽部分抗原,染 色 前用酶消化,以暴露抗原決定簇.
(2)4%多聚甲醛緩沖液:
配制: 40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml, 加熱 攪拌(注意不要沸騰)至溶液清亮后，室溫下冷卻后加PBS, 使總容量為1000ml
特點：此固定劑對抗原的保護優于甲醛緩沖液但價格高與甲醛
(3)戊二醛-多聚甲醛緩沖液
配制：在上述溶液中加入1%的戊二醛.
特點：多用于電鏡的免疫組織化學研究
(4)Bouin液
配制：40%甲醛250ml，冰醋酸50ml,飽和苦味酸750ml.
特點：穿透力強，組織收縮小. 比單獨用甲醛固定更適合于免疫組織化學研究
(5) PLP液 (過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液)
此固定劑比較適合富含糖類組織的固定,對超微結構及許多抗原的保存均較好, 但配制比較繁瑣
二.)丙酮及醇類固定劑
固定原理是使組織中的蛋白質和糖類沉淀.此類固定劑的穿透能力強,對抗原保存較好,但對小分子蛋白質及多肽等物質的保存效果較差.常與其他固定劑 如 冰醋酸,乙醚,氯等混合使用.
(1)AAA液: 純酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml
(2)Clzrke液：純酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰凍切片的后固定
(3)Carnoy液: 純酒精60ml，氯30ml，冰醋酸10ml. 多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原 的固定保存。
(4) 丙酮：常用于冰凍切片和細胞涂片的后固定。用前在4度冰箱預冷，切片在冷丙酮中固定5～10min.
三.)其他固定劑
(1) Zenker液 適合免疫球蛋白抗原的檢測。
(2) 四氯化鋨液 是電鏡研究中所必需的固定液
選擇*固定劑的標準是：
組織形態保存良好; zui大限度地保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應用zui廣的固定劑。
3. 包埋
包埋的目的是使組織保持一定的形狀和硬度，便于用切片機切片.常見的包埋劑及方法如下:
石蠟包埋 石蠟是組織病理切片中zui常用的包埋劑. 需要脫水, 透 明,浸臘等過程.
冰凍包埋 是作冰凍切片的包埋方法. 新鮮的及以固定的材料均 適合于冰凍包埋. 常用的包埋劑是OCT
塑料包埋 常用的是環氧樹脂包埋劑. 優點是同時可以作光鏡和 電鏡觀察
碳臘包埋 較少用.包埋劑為聚乙二醇
4. 切片
因為免疫組化的步驟較多, 要求切片薄而且平整, 否則在染色過程中容易脫片.一般要求片厚在4um以下。貼片前普通的載玻片要作適當的處理。
(1)洗片 酸液浸泡過夜，流水沖洗，蒸餾水洗，95%酒精浸
泡 2h，擦干。
(2)涂膠 常用的防脫片劑有：多聚賴氨酸，APES及白乳膠。
使用方法見試劑使用說明書。
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