Western Blot技術服務，常規指標贈送一抗二抗
更新時間：2018-08-07 點擊次數：988次Western Blot技術服務，常規指標贈送一抗二抗。
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操作步驟
試劑準備
1、SDS-PAGE試劑：見電泳實驗。
2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3、轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。
6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0μl。
樣品制備
1、單層貼壁細胞總蛋白的提取：
（1）倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
（2）每瓶細胞加3ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈后把培養瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）
（4）每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。
（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中（整個操作盡量在冰上進行）。
（6）于4℃下12000rpm離心5min（提前開離心機預冷）。
（7）將離心后的上清分裝轉移到0.5ml的離心管中放于－20℃保存。
2、組織中總蛋白的提取：
（1）將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
（2）加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。
（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。
3、加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取：
由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：
（1）將培養液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。
（2）棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。
（3）用槍洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。
（4）將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。
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