上海信帆生物提供免疫組化代測服務(wù)
更新時(shí)間：2015-08-31 點(diǎn)擊次數(shù)：1289次免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項(xiàng)技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。
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一、基本原理
抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫組織化學(xué)正是利用了這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動(dòng)物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細(xì)胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無色的，因此還必須借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來，以其達(dá)到對組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量的研究。
幾種常用的免疫組織化學(xué)方法的原理
免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)
將已知抗體標(biāo)上熒光素,以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原,在熒光顯微鏡下觀察.當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會(huì)發(fā)出一定波長的熒光,從而可以確定組織中的抗原定位或定量.
免疫酶細(xì)胞化學(xué)
是目前免疫組織化學(xué)研究中zui常用的技術(shù).基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原進(jìn)行定位或定性研究.
免疫膠體金技術(shù)
就是用膠體金標(biāo)記一抗，二抗或其他的能特異性的結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性，定位或定量研究.由于膠體金的電子密度高，多用于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記的定位研究.
免疫組織化學(xué)的全過程包括：①抗原的提取與純化;③免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化;③將顯色劑與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體;④標(biāo)本的制備;③免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng);⑧觀察結(jié)果。
二、免疫組織化學(xué)基本技術(shù)
1.材料
免疫組織化學(xué)可用于多種材料.如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,人體組織,細(xì)胞和體外培養(yǎng)細(xì)胞都可用于免疫組化研究.
一.)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 種類很多，以狗，兔，大鼠和小鼠zui為常用.關(guān)鍵是取材迅速，大小適宜，固定充分.
二.)人體材料 包括活檢和手術(shù)切除的標(biāo)本，以及通過各種手段收集的細(xì)胞都可用于免疫組化研究.如 脫落細(xì)胞 穿刺涂片 骨髓涂片 血涂片等.
三.)體外培養(yǎng)的細(xì)胞標(biāo)本 根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性采用不同的方法.對于貼壁生長的細(xì)胞可采用在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部放置載玻片，讓細(xì)胞在其上面生長，到時(shí)將載玻片取出進(jìn)行固定，染色.懸浮生長的細(xì)胞可采用離心涂片或離心后細(xì)胞團(tuán)塊固定，脫水，包埋，切片的方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。
2 .固定
固定的目的在于保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整，盡量保存組織中的抗原，使其不被破壞或擴(kuò)散，以減少非特異性染色或假陽性，假陰性的結(jié)果.
選擇固定方法的原則是:
在保持組織形態(tài)的完好和被檢測抗原的前提下,盡量應(yīng)用濃度zui低的固定劑及zui短的固定時(shí)間.
常用固定劑
一.)醛類固定劑 起作用是使組織之間相互交聯(lián),將抗原保存在原位.此類固定劑的特點(diǎn)是對組織的穿透力強(qiáng),組織收縮性小.常用的有甲醛,多聚甲醛和戊二醛.可單用也可聯(lián)合使用.
(1)3% 中性甲醛固定液液:
配制: 30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml
特點(diǎn): 滲透性好,能完好地保護(hù)組織結(jié)構(gòu)和某些抗原.由于交 聯(lián)作用會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性,會(huì)遮蔽部分抗原,染 色 前用酶消化,以暴露抗原決定簇.
(2)4%多聚甲醛緩沖液:
配制: 40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml, 加熱 攪拌(注意不要沸騰)至溶液清亮后，室溫下冷卻后加PBS, 使總?cè)萘繛?000ml
特點(diǎn)：此固定劑對抗原的保護(hù)優(yōu)于甲醛緩沖液但價(jià)格高與甲醛
(3)戊二醛-多聚甲醛緩沖液
配制：在上述溶液中加入1%的戊二醛.
特點(diǎn)：多用于電鏡的免疫組織化學(xué)研究
(4)Bouin液
配制：40%甲醛250ml，冰醋酸50ml,飽和苦味酸750ml.
特點(diǎn)：穿透力強(qiáng)，組織收縮小. 比單獨(dú)用甲醛固定更適合于免疫組織化學(xué)研究
(5) PLP液 (過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液)
此固定劑比較適合富含糖類組織的固定,對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的保存均較好, 但配制比較繁瑣
二.)丙酮及醇類固定劑
固定原理是使組織中的蛋白質(zhì)和糖類沉淀.此類固定劑的穿透能力強(qiáng),對抗原保存較好,但對小分子蛋白質(zhì)及多肽等物質(zhì)的保存效果較差.常與其他固定劑 如 冰醋酸,乙醚,氯仿等混合使用.
(1)AAA液: 純酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml
(2)Clzrke液：純酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰凍切片的后固定
(3)Carnoy液: 純酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml. 多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原 的固定保存。
(4) 丙酮：常用于冰凍切片和細(xì)胞涂片的后固定。用前在4度冰箱預(yù)冷，切片在冷丙酮中固定5～10min.
三.)其他固定劑
(1) Zenker液 適合免疫球蛋白抗原的檢測。
(2) 四氯化鋨液 是電鏡研究中所必需的固定液
選擇*固定劑的標(biāo)準(zhǔn)是：
組織形態(tài)保存良好; zui大限度地保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應(yīng)用zui廣的固定劑。
3. 包埋
包埋的目的是使組織保持一定的形狀和硬度，便于用切片機(jī)切片.常見的包埋劑及方法如下:
石蠟包埋 石蠟是組織病理切片中zui常用的包埋劑. 需要脫水, 透 明,浸臘等過程.
冰凍包埋 是作冰凍切片的包埋方法. 新鮮的及以固定的材料均 適合于冰凍包埋. 常用的包埋劑是OCT
塑料包埋 常用的是環(huán)氧樹脂包埋劑. 優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)可以作光鏡和 電鏡觀察
碳臘包埋 較少用.包埋劑為聚乙二醇
4. 切片
因?yàn)槊庖呓M化的步驟較多, 要求切片薄而且平整, 否則在染色過程中容易脫片.一般要求片厚在4um以下。貼片前普通的載玻片要作適當(dāng)?shù)奶幚怼?/p>
(1)洗片 酸液浸泡過夜，流水沖洗，蒸餾水洗，95%酒精浸
泡 2h，擦干。
(2)涂膠 常用的防脫片劑有：多聚賴氨酸，APES及白乳膠。
使用方法見試劑使用說明書。
三、常用的免疫組織化學(xué)方法
自從1941年Coons及其同事*免疫組織化學(xué)技術(shù)以來，伴隨著免疫學(xué)和組織化學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，從zui初的直接法, 到現(xiàn)在的各種間接法的發(fā)展, 免疫組織化學(xué)發(fā)生了日新月異的變化.現(xiàn)在就從zui初的直接法開始到現(xiàn)在常用的免疫組織化學(xué)方法作一簡單介紹.
一. ）直接法: 是zui早出現(xiàn)的方法,是將酶直接標(biāo)記在特異性抗體上,與標(biāo)本中的抗原結(jié)合,讓酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì),可以在光鏡下檢測. 直接法放大作用小,不夠敏感, 且標(biāo)記一種抗體只能檢測一種抗原,所以應(yīng)用就受到了限制.
二. ）間接法
是將酶標(biāo)記在第二抗體上,形成抗原/一抗 /二抗-酶復(fù)合物,zui后酶底物顯色來放大信號(hào). 由于一抗多來源于兔,小鼠或山羊等有限的幾種動(dòng)物,所以僅需制備酶標(biāo)記的一抗來源的IgG就可以檢測很多的抗體,放大效果也有所提高.為了追求更大的放大效果,人們有發(fā)明了PAP的橋聯(lián)法,雖然敏感性有所提高,但是同時(shí)出現(xiàn)了較高的非特異性背景,及假陽性等問題.隨后被生物素-卵白素系統(tǒng)所取代。
三. ）生物素-卵白素系統(tǒng) (親和免疫組織化學(xué))
生物素(biotin)是一種244Da的小分子的維生素。卵白素(avidin)又稱作抗生物素是一種68kDa的糖蛋白。生物素與抗生物素有很強(qiáng)的親合力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時(shí)，生物素和抗生物素都具有與其他示蹤劑，如熒光素，過氧化物酶等相結(jié)合的能力。近年來，應(yīng)用這一系統(tǒng)特性，研制出了許多檢測方法，如ABC法，SP法等。
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