免疫組化實驗過程中操作的要領是什么
更新時間：2015-07-06 點擊次數：1199次我們在做免疫組化實驗的時候，總是會遇到這樣那樣的問題，上海信帆生物科技有限公司告訴大家免疫組化實驗過程中操作的要點具體是什么？
1.固定：用 4% 的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而的固定液，請于購置前注意說明書。
Bouin S 固定液：飽和苦味酸 750ml ，甲醛 250ml ，冰醋酸 50ml ，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的保存。
PLP 液：即高碘酸鈉 - 賴氨酸 - 多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。
2 ．組織脫水，透明：時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整。
3 ．切片時展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。
4 ．烤片： 60℃ 30 分鐘或 37℃ 過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。
5 ．蠟塊及切片的保存：在 4℃ 保存
6 ．脫片問題： Poly-L-Lysine( 多聚賴氨酸 ) 為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑， 6ml 的多聚賴氨酸溶液可按 1:10 稀釋成 60ml 的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（ APES 和 Poly-L-Lysine ）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在 APES 1 ： 50 丙酮溶液中浸泡 3 分鐘，晾干，即可進行下一步。
7 ．滅活內源性酶： HRP 系統： 3% 雙氧水滅活； AP 系統： 3%HAc 滅活。
8 ．暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度 ( 不同抗體的*修復液請參閱抗體說明書 ) 。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。
9 ．封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉
10 ．抗體稀釋：應遵循 “ 現用現配 " 的原則，對于 PBS 稀釋的抗體一定要當天使用。
11 ．背景高：在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含 1‰ Tween20 的 PBS 洗，特別是在顯色之前要多洗。
12 ．返藍：在蘇木素復染后，可用堿性緩沖液（如 PBS ）或 Na2HPO4 的飽和溶液返藍。
13 ．顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。
