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上海信帆報道:免疫染色固定液

更新時間:2015-04-15   點擊次數:1155次

上海信帆生物代理銷售  免疫染色固定液,現貨供應,歡迎。

免疫染色實驗方法和步驟編輯

1.樣品準備(Sample preparation)

對于貼壁細胞:

Ø 可以直接用多孔板,例如6孔板、24孔板等,培養細胞,然后到預定時間時進行固定等后續操作。 Ø 也可以用潔凈的蓋玻片,70%乙醇中浸泡后,用無菌的鑷子放置到6孔板內,然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養液洗去殘留的乙

醇。這時就可以種入細胞進行培養,待細胞貼在蓋玻片上生長良好后,即可進行固定等后續操作。

對于懸浮細胞:

Ø 把細胞先在固定液中固定,然后把細胞滴加在載玻片上,干燥后細胞會緊貼在載玻片上。然后就可以進行后續操作。如果細胞的 粘附能力不佳,可以在載玻片上用PDL等物質進行處理,以增強載玻片的粘附能力。

對于冷凍切片:

Ø

切片放置在載玻片上后,可以直接進行固定等后續操作。

對于石蠟切片:

Ø 脫蠟:切片在二甲苯中脫蠟5分鐘,再換用新鮮的二甲苯脫蠟,共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鐘,兩次。90%乙醇5分鐘,兩

次,70%乙醇5分鐘,一次。蒸餾水5分鐘,兩次。

Ø 抗原修復:根據不同的抗原和抗體,可以選擇把切片放置在如下抗原修復液中,10mM檸檬酸鈉,pH6.0,或1mM EDTA,pH8.0,

或10mM Tris, pH10.0,95℃加熱12分鐘,大約在30分鐘內緩慢冷卻至室溫。

2.固定

Ø 可以使用適當的固定液固定細胞或切片,例如碧云天生物試劑的免疫染色固定液。固定完畢后,可以用免疫染色洗滌液洗滌兩次,每 次5分鐘。

3.封閉(Blocking)

Ø

加入免疫染色封閉液,封閉60分鐘。如果背景較高,可以4℃封閉過夜。

Ø

從封閉開始所有的步驟,一定要注意樣品的保濕,避免樣品的干燥,否則極易產生較高的背景。

Ø 在整個免疫染色過程中我們使用碧云天的側擺搖床,側向擺動速度比較緩慢,而且也容易讓溶液覆蓋樣品。如果樣品比較容 易脫落,也可以把所有的步驟放置在桌面上靜止進行,即封閉、抗體孵育、洗滌等步驟均不需搖動,但靜止操作時宜適當延長作

用時間或次數。

4.一抗孵育(Primary antibody incubation)

Ø

參考一抗的說明書,按照適當比例用免疫染色一抗稀釋液稀釋一抗。

Ø 用微型臺式真空泵吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效

果不佳,可以4℃緩慢搖動孵育過夜。

Ø 回收一抗。加入免疫染色洗滌液, 在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5分鐘。共洗滌3次。

如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

5.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

Ø 參考二抗的說明書,按照適當比例用免疫熒光染色二抗稀釋液稀釋熒光標記的二抗,或者用免疫染色(非熒光)二抗稀釋液稀釋辣 根過氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或堿性磷酸酯酶(AP)標記的二抗。 Ø

用微型臺式真空泵吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。

Ø 回收二抗。加入免疫染色洗滌液, 在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5分鐘。共洗滌3次。

如果結果背景較高,可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

6.蛋白檢測(Detection of proteins)

Ø

對于免疫熒光染色,此時已經可以直接到熒光顯微鏡下觀察。

Ø

對于非免疫熒光染色可以選用DAB等適當的顯色底物,或AB檢測體系等進行后續檢測。

7.多重染色(Multiple staining)

Ø 如果進行的是免疫熒光染色,通常都可以進行多重染色。對于可以產生有色沉淀物的染色反應,例如DAB染色,一般不適合再進

行多重染色。

Ø 多重熒光染色: 可以使用紅色熒光、綠色熒光和藍色熒光進行三重熒光染色。例如用免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3進行紅色熒光染色,隨后可 以用免疫熒光染色試劑盒-抗兔Cy2進行綠色熒光染色,在完成上述兩種染色后可以使用Hoechst染色試劑盒對細胞核進行染色,

染色后為藍色熒光。

Ø 用HE染色進行復染:

免疫熒光染色后可以用蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒進行HE染色。

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