谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說明書 測定意義 分光光度法 50 管/24 樣 GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，催化銨離子和谷氨 酸合成谷氨酰胺，不僅可以防止過多的銨離子對生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲 存和運輸形式。 測定原理 GS 在 ATP 和 Mg2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進一步轉(zhuǎn)化為γ─ 谷氨酰基異羥肟酸，在酸性條件下與鐵形成紅色的絡(luò)合物；該絡(luò)合物在 540nm 處有zui大吸 收峰，可用分光光度計測定。 所需的儀器和用品 可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。 試劑的組成和配制 提取液：30mL×1 瓶，4℃保存。 試劑一：10mL×1 瓶，-20℃保存。 試劑二：10mL×1 瓶，-20℃保存。 試劑三：粉劑×2 瓶，-20℃保存。用時每瓶加入 5mL 蒸餾水充分溶解備用，用不完的試劑仍 -20℃保存。 試劑四：10mL×1 瓶，4℃保存。 樣本測定的準備 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 測定步驟 1、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。 2、 在 EP 管中加入下列試劑： 試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 試劑一 | 320 | | 試劑二 | | 320 | 試劑三 | 140 | 140 | 樣本 | 140 | 140 |
混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）準確水浴 30min 混勻，靜置 10min 后，5000g，常溫離心 10min，取上清液測定 540nm 處的吸光值 A。△A=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。 GS 活力單位的計算 （1）按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每 min 使 540nm 下吸光值變化 0.01 定義 為一個酶活力單位。 GS（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr （2）按樣本鮮重計算： 單位的定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每 min 使 540nm 下吸光值變化 0.01 定義為一個 酶活力單位。 GS（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =19×ΔA÷W V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.8mL； V 樣：加入樣本體積，0.14mL；V 樣總：加入提取液 體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。 |
