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丙酮酸（pyruvic  acid PA）檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書下載

測(cè)定意義：

丙酮酸通過(guò)乙酰 CoA 連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。

測(cè)定原理：

丙酮酸與 2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在堿性溶液中呈櫻紅色。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 5mL×1 瓶， 4℃保存； 試劑二：液體 25mL×1 瓶， 4℃保存。 丙酮酸提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），靜置 30min， 8000g，常溫離心 10min，取上清待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，靜置 30min，8000g，常溫離心 10min，取上清待測(cè)。 3、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建 議取 0.1mL 血清（漿）加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，靜置 30min， 8000g，常溫離心 10min，取上清待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 520nm，蒸餾水調(diào)零。

2、取 300μL 樣本+100μL 試劑一于 1.5mL EP 管中，混勻，靜置 2min，加入 500μL 試劑二， 混勻，于 520nm 波長(zhǎng)處測(cè)定管吸光值 A。

丙酮酸含量計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0466x + 0.0675； x 為丙酮酸鈉含量（μg/mL），y 為吸 光值。

2、按照血清（漿）體積計(jì)算

丙酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（V3×V1÷V2）=214.6×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算

丙酮酸含量（μg/g 鮮重）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2）=21.46×(A-0.0675) ÷W

3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

丙酮酸含量（μg/104 cell）＝[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（500×V1÷V2）=0.043×(A-0.0675)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.3mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿） 體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬(wàn)。