人腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫分析 試劑盒使用說明書
檢測范圍： 20 ng/L -400 ng/L
使用目的： 本試劑盒用于測定人關節液樣本中腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量。 實驗原理 本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。用純化的人腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入腫瘤壞死因子α（TNF-α），再與HRP標記的腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子α（TNF-α）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人腫瘤壞死因子α（TNF-α）濃度。 試劑盒組成 1 | 20倍濃縮洗滌液 | 20ml×1瓶 | 7 | 終止液 | 3ml×1瓶 | 2 | 酶標試劑 | 3ml×1瓶 | 8 | 標準品（800ng/L） | 0.5ml×1瓶 | 3 | 酶標包被板 | 12孔×4條 | 9 | 標準品稀釋液 | 1.5ml×1瓶 | 4 | 樣品稀釋液 | 3ml×1瓶 | 10 | 說明書 | 1份 | 5 | 顯色劑A液 | 3ml×1瓶 | 11 | 封板膜 | 2張 | 6 | 顯色劑B液 | 3ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1個 |
標本要求 1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融 2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟 - 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
400 ng/L | 5號標準品 | 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液 | 200 ng/L | 4號標準品 | 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液 | 100 ng/L | 3號標準品 | 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液 | 50 ng/L | 2號標準品 | 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液 | 25 ng/L | 1號標準品 | 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
- 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
- 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
- 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用
- 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
- 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
- 溫育：操作同3。
- 洗滌：操作同5。
- 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.
- 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
- 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
計算 以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。 注意事項 1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。 2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。 3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，使用排槍加樣。 - 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
- 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。 7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準. 8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 9．本試劑不同批號組分不得混用。 保存條件及有效期 1．試劑盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6個月
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