明膠酶譜法試劑盒說明書
Page 1 of 2 MMP Zymography Assay Kit (for MMP-2 and MMP-9) XF-P1700 描述:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解 細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱膠原酶。通過影響細(xì)胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織 重塑等過程,并參與炎癥、腫瘤、、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9 參與各種生理與病理過程,其在診斷和治療中的意義日益受到重視1。 本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基 于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,其靈敏度可達(dá)1 nM,高于ELISA 方法2,其 基本原理和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電 泳, 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色 而形成透亮區(qū)域,從而能同時指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供 MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP- 9 酶譜及活性,檢測靈敏度~1 nM。試劑盒可進(jìn)行50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測,如果小膠加樣孔為10~15 個,則總計(jì)可檢測500~750 個樣品。 適用: 檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM)。組成與儲存(50 assays): 1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC; 2. 10 × Substrate G,50 ml, ?20 oC; 3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸餾水稀釋; 4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸餾水稀釋; 5. SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(#P1501), 4 oC。 檢測步驟: 1. 制備含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝膠:分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDSPAGE 凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 oC 加熱5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入10 × substrate G 并使之稀釋10 倍,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。 2. 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽 性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。 3. 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。 4. 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。 5. 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37oC 孵育1~5 小時。陽性 對照或者血中的MMP 通常37oC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低,應(yīng)延長孵育時間為 10 小時或過夜。 6. 顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(操作步驟見SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP 條帶的位置 不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透明條帶。 7. 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP 條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設(shè)置為黑色。 MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。 Page 2 of 2
明膠酶譜法試劑盒說明書 說明
1. 10 mM 能夠EDTA *抑制MMP 活性。 2. 凝膠干燥:可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠,作為*記錄保留。 參考文獻(xiàn): 1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494 2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,1980, 102, 196–202 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書P1501 常規(guī)考馬斯亮藍(lán)SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度 高,但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害,操作步驟繁瑣,難以控制獲得好的染色效果。 染色步驟: 1. 此染色液即為工作液,使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝膠, 并緩慢搖動2h; 2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠; 3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動2h,傾去脫色液,再加入新脫色液進(jìn)行脫色,直至獲得清晰的 藍(lán)色的條帶和干凈的背景(通常此過程需要2~4h,也可脫色過夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈 的背景); 4. 對凝膠進(jìn)行分析和照相,凝膠可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對 凝膠進(jìn)行處理后保存。 安全性:含有甲醇,無特殊毒性,按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。 說明: 1. 染色液配方:0.25g考馬斯亮藍(lán)R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,定容至1000ml,混合1h 后用 Whatman 1 號濾紙過濾,于室溫可無限期保存; 2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88(V:V:V); 3. 保存液:7%冰醋酸; 4. 凝膠染色之后,染色液可以回收利用,裝入新容器內(nèi),室溫或4 oC 保存,可反復(fù)使用2-4 次。
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