高鐵血紅蛋白（MetHb）測試盒說明書 一、實驗儀器：試管、微量移液器、旋渦混勻器、可見分光光度計（540、602和630nm） 二、適用范圍：本試劑盒可測各種動物全血等樣本中高鐵血紅蛋白含量； 三、測定意義：體內一氧化氮彌散入血后，很快與氧合血紅蛋白結合形成高鐵血紅蛋白（methemoglobin, MetHb），NO與MetHb變化相關，故全血MetHb檢測近年來受到的廣泛重視。同時血液中高鐵血紅蛋白含量的測定對接觸芳香族氨基、硝基化合物所引起的中毒性疾病的診斷與治療，有重要的意義。 四、試劑組成及配制： A.試劑一：血紅蛋白測定濃縮液，1ml X 2支,2—8℃保存。 血紅蛋白測定應用液的配制：臨用前將濃縮液用雙蒸水1:99稀釋，即100倍稀釋，現用現配。配好的試劑2—8℃避光保存，可存放一個月以上。 B.試劑二: 高鐵血紅蛋白測定濃縮液，30ml X 1瓶，2—8℃。 高鐵血紅蛋白測定應用液的配制： 濃縮液:雙蒸水=1:9稀釋，即10倍稀釋，可存放6個月以上。 C.試劑三：制作還原血紅蛋白曲線用 ① 白色粉劑 X 1支，2—8 ℃避光保存。 ② 稀釋液，1ml X 1支，2—8 ℃保存。 試劑三應用液配制：臨用前每支粉劑加入1ml稀釋液，現用現配，注意避光。 D.試劑四：制作高鐵血紅蛋白曲線用 ① 磚紅色粉劑 X 1支，2—8℃避光保存。 ② 稀釋液，1ml X 1支，2—8℃保存。 試劑四應用液配制：臨用前每支粉劑加入1ml稀釋液，現用現配，注意避光 五、操作過程： 1、制備抗凝全血：取全血立即加入到肝素抗凝管內，加蓋封口，輕輕顛倒混勻。 2、血紅蛋白含量的測定：取 0.01ml 全血與 2.5ml 的 100 倍稀釋的試劑一應用液（血紅蛋白測定應用液），混勻，靜置5分鐘后，1cm光徑，雙蒸水調零，540nm處測定各管吸光度值。 3、高鐵血紅蛋白測定： 取0.05ml全血，加入2.5ml的試劑二稀釋應用液（即高鐵血紅蛋白測定應用液），混勻，靜置5分鐘后，1cm光徑，雙蒸水調零，測定630nm處及602nm處吸光度值。如果沒有雙波長的分光光度計則可以先測定各管630nm處吸光度值，然后再測各管602 nm處吸光度值。但一定要注意各管的編號不要弄錯。 六、計算公式： ①、血紅蛋白含量的計算：血紅蛋白克數/升=540nm處吸光度值×367.7 ②、高鐵血紅蛋白百分比計算： MetHb% = (A630nm—r x A602nm)÷(A602nm x(R— r)) ×100% ③、高鐵血紅蛋白含量的計算：高鐵血紅蛋白克數 /升 = MetHb%×血紅蛋白克數/升 【注1】 A630即在630nm波長時樣本的吸光度值；A602即在602nm波長時樣本的吸光度值 【注2】 R與r均為常數，R=1.81；r=0.14。（本研究所測定常數） 即計算公式可以簡化為： ①、高鐵血紅蛋白百分比： MetHb% = (A630nm—0.14×A602nm) ÷(A602nm ×1.67) ×100% ②、高鐵血紅蛋白含量的計算：高鐵血紅蛋白克數/升 = MetHb%×血紅蛋白克數 /升 七、計算舉例： ①、取吸煙人全血，立即加入到肝素抗凝管，加蓋封口，輕輕顛倒混勻。 ②、取該全血0.01ml與2.5ml的100倍稀釋的試劑一應用液（血紅蛋白測定應用液），混勻，靜置5分鐘后，1cm光徑，雙蒸水調零，測定吸光度值為0.373，則通過公式可計算出血紅蛋白含量。 血紅蛋白含量計算：血紅蛋白克數/升=540nm處吸光度值x 367.7 =0.373 X367.7=137.15克/升 ③、再取該全血0.05ml，加入2.5ml的試劑二稀釋應用液(即高鐵血紅蛋白測定應用液），混勻，靜置5分鐘后，1cm光徑，雙蒸水調零，測得602nm處的吸光度值為0.226,測定管630nm處的吸光度值為0.066，通過公式可計算出高鐵血紅蛋白百分比： 高鐵血紅蛋白百分比計算：MetHb%=(A630nm- r×A602nm)÷(A602nm x(R- r)) ×100% =(0.066-0.14x0.226)÷(0.226x1.67)x100%=9.10% 高鐵血紅蛋白含量的計算：高鐵血紅蛋白克數/升= MetHb%X血紅蛋白克數/升 =0.091x137.15克/升=12.486克/升 八、注意事項： ①、取血后應在1小時內完成實驗，否則影響測定結果，因為紅細胞中的還原酶可使高鐵血紅蛋白逐漸還原，使結果降低。但可放-20℃以下冷凍保存，如果血樣較多，可將全血分成幾小管，每次測試可取其一小管，每次測試可取其一小管，余下各管仍保存-20℃以下以備重復測試，其結果不受影響。 ②、本實驗可用雙波長分光光度計測定，可同時測定602nm處及630nm處吸光度值，進行計算。也可用單波長分光光度計測定，可以先測定各管630nm處吸光度值，然后再測各管602nm處吸光度值。但一定要注意各管的編號不要弄錯。 ③如果實驗室分光光度計沒有雙波長掃描功能，可以不做標準曲線，直接用本實驗室數據。R與r均為常數，R=1.81;r=0.14 4所用器皿要干凈。 |
