測定意義： LPS又稱甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和單酯）。LPS廣泛的存在于各種生物中。血清中LPS的異常增高常見于胰腺炎和胰腺癌。 測定原理： LPS催化油酯水解成脂肪酸，利用銅皂法測定脂肪酸生成速率，即可計算LPS活性。 自備儀器和用品： 研缽、臺式離心機、震蕩混勻器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍、甲苯、無水乙醇、冰和蒸餾水。 試劑組成和配制： 試劑一：液體×2瓶，4℃保存。 試劑二：液體×1瓶，室溫保存。 試劑三：液體×1瓶，4℃保存。 標準品×1瓶，10 µmol/mL的標準溶液，室溫保存。臨用前加入3.168 mL無水乙醇，充分溶解。 粗酶液提取： 稱取約0.1g樣品，加試劑一1 mL充分研磨，16000rpm 4℃離心40min，取上清液待測。 LPS測定操作： - 分光光度計預熱30 min以上，調節波長到710 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑一和試劑二置于37℃水浴預熱30min以上。 3. 空白管：取1.5 mL EP管，依次加入150μL試劑一和50μL試劑二，反復震蕩混勻；加入5μL蒸餾水，迅速震蕩混勻后置于37℃水浴準確反應10 min；加入400μL甲苯，反復震蕩混勻后，室溫4000rpm離心10min；取出離心管，小心吸取上層溶液200μL，加入另一1.5mL EP管，再加入50μL試劑三，反復震蕩混勻；室溫4000rpm離心10min，小心吸取上層溶液150μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm處測定吸光值。記為A空白管。 4. 標準管：取1.5 mL EP管，依次加入150μL試劑一和50μL試劑二，反復震蕩混勻；加入5μL標準品，迅速震蕩混勻后置于37℃水浴準確反應10min；加入400μL甲苯，反復震蕩混勻后，室溫4000rpm離心10min；取出離心管，小心吸取上層溶液200μL，加入另一1.5mL EP管，再加入50μL試劑三，反復震蕩混勻；室溫4000rpm離心10min，小心吸取上層溶液150μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm處測定吸光值。記為A標準管。 5. 測定管：取1.5mL EP管，依次加入150μL試劑一和50μL試劑二，反復震蕩混勻；加入5μL上清液，迅速震蕩混勻后置于37℃水浴準確反應10min；加入400μL甲苯，反復震蕩混勻后，室溫4000rpm離心10min；取出離心管，小心吸取上層溶液200μL，加入另一1.5mL EP管，再加入50 μL試劑三，反復震蕩混勻；室溫4000rpm離心10 min，小心吸取上層溶液150 μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm處測定吸光值。記為A測定管。 LPS活性計算： a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下 （1）按蛋白濃度計算 活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/mg prot) =[V反總×C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷（Cpr×V樣÷V樣總) ÷T=0.1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)÷Cpr （2）按樣本鮮重計算 活性單位定義：37℃中每克樣品每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/g 鮮重) =[ V反總×C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=0.1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)÷W C標準品：10 µmol/mL；V標準品：加入反應體系中標準品體積，0.005 mL；V反總：反應體系總體積，205μL=2.05×10-4L；V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.005 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；T：催化反應時間，10 min。 b.使用96孔板測定的計算公式如下 （1）按蛋白濃度計算 活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/mg prot) =[V反總×C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷（Cpr×V樣÷V樣總) ÷T=0.1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)÷Cpr （2）按樣本鮮重計算 活性單位定義：37℃中每克樣品每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/g 鮮重) =[ V反總×C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=0.1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)÷W C標準品：10 µmol/mL；V標準品：加入反應體系中標準品體積，0.005 mL；V反總：反應體系總體積，205μL=2.05×10-4L；V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.005 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；T：催化反應時間，10 min。 注意事項： 1、甲苯有毒，實驗過程中需佩戴手套和口罩。 2、實驗過程中須遠離火源。 |
