測定意義： LPL（lipoprotein lipase）存在于肝外組織毛細血管內皮細胞表面，催化血漿中乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)中甘油三酯(TG)的水解，在CM及VLDL的降解中發揮重要作用。HL（hepatic lipase）僅存在于肝內皮細胞表面，在中密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)代謝中起重要作用。LPL 和HL活性降低，可引起高甘油三酯血癥。在高脂血癥、動脈粥樣硬化的發病機理及脂蛋白代謝研究中，常常需要測定LPL及HL活性。 測定原理： LPL和HL均能水解乳劑中TG，生成游離脂肪酸；進一步通過銅試劑法測定體系中游離脂肪酸的生成。 自備儀器和用品： 研缽、冰、臺式離心機、微量注射器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍、肝素鈉、氯坊（三氯鉀烷）、無水乙醇和蒸餾水。 試劑組成和配制： 試劑一：液體×1瓶，4℃保存。 試劑二：液體×1瓶，室溫保存。 試劑三：自備。實驗前1 d，在10 mL試劑瓶中加入4.8 mL正庚烷，0.2 mL無水鉀醇，5 mL氯坊（自備），蓋緊后混勻，室溫保存。 試劑四：液體×1瓶，室溫保存。 試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前向試劑瓶中加入5 mL無水乙醇，充分溶解。 標準品：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前向試劑瓶中加入7.8 mL氯坊充分溶解，即為500μmol/L的棕櫚酸標準溶液。 粗酶液提取： 1、血液中LPL與HL活性測定：按動物體重，150U/kg肝素鈉溶液靜脈注射，20min后取血液，即下表中粗酶液，待測。 2、組織中LPL與HL活性測定：組織用生理鹽水沖洗干凈后，用吸水紙吸取表面水分，稱取約0.1 g樣品，加入1 mL生理鹽水，冰浴勻漿，8000rpm，4℃離心10min，取上清液，即粗酶液，待測。 LPL和HL測定操作： 1. 分光光度計預熱30 min以上，調節波長到550 nm，蒸餾水調零。 2. 空白管：取帶蓋 玻璃試管，加入2 μL蒸餾水，100μL試劑三，40 μL試劑四，40μL試劑五，蓋緊后充分震蕩混勻（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，靜置15min，于550nm光吸收，記為A空白管。 3. 標準管：取帶蓋 玻璃試管，加入2 μL標準液，100μL試劑三，40 μL試劑四，40μL試劑五，蓋緊后充分震蕩混勻（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，靜置15min，于550nm光吸收，記為A標準管。 4. 總脂酶測定管：取帶蓋玻璃試管，加入10 μL粗酶液，100μL蒸餾水，100μL試劑二，蓋緊后混勻；37℃水浴準確保溫60min；吸取2μL上述溶液，加入另一個0.5mL EP管，加入100μL試劑三，40 μL試劑四，40μL試劑五，蓋緊后充分震蕩混勻（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，靜置15min，于550nm光吸收，記為A總脂酶管。 5. 肝脂酶測定管：取帶蓋玻璃試管，加入10 μL粗酶液，100μL試劑一，100μL試劑二，蓋緊后混勻；37℃水浴準確保溫60min；吸取2μL上述溶液，加入另一個0.5mL EP管，加入100μL試劑三，40 μL試劑四，40μL試劑五，蓋緊后充分震蕩混勻（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，靜置15min，于550nm光吸收，記為A肝脂酶管。 LPL和HL活性計算： a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下 1.血液中LPL與HL活性計算 活性單位定義：37℃中每毫升血清（漿）每分鐘在反應系統中所產生的 1 μ mol FFA。 總脂酶活性（U/mL）=[ C標準液÷(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V反總÷(V樣÷V樣總)÷T =0.7×(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) 肝脂酶（HL）活性（U/mL）=0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=總脂酶活性－HL C標準液：標準品濃度，500 μmol/L=0.5 μmol/mL；V反總：催化反應體系總體積，10+100+100=210μL=0.21 mL；V樣：加入催化反應體系中粗酶液體積，10μL；V樣總：粗酶液總體積，1mL=1000μL；T：催化反應時間，15 min。 2. 組織中LPL與HL活性計算 （1）按蛋白濃度計算 37℃中每毫克蛋白每分鐘內催化產生1μmol FFA。 總脂酶活性（U/mg pr） =[ C標準液÷(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V反總÷(Cpr×V樣)÷T =0.7×(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷Cpr 肝脂酶（HL）活性（U/mL） =0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷Cpr 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=總脂酶活性－HL （2）按樣本鮮重計算 37℃中每克樣品每分鐘內催化產生1μmol FFA。 總脂酶活性（U/g 鮮重） =[ C標準液÷(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T =0.7×(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷W 肝脂酶（HL）活性（U/mL）=0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷W 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=總脂酶活性－HL C標準液：標準品濃度，500 μmol/L=0.5 μmol/mL；V反總：催化反應體系總體積，10+100+100=210μL=0.21 mL；V樣：加入催化反應體系中粗酶液體積，50μL=0.05 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：粗酶液蛋白質濃度，mg/mL；T：催化反應時間，15 min。 b.使用96孔板測定的計算公式如下 1.血液中LPL與HL活性計算 活性單位定義：37℃中每毫升血清（漿）每分鐘在反應系統中所產生的 1 μmol FFA。 總脂酶活性（U/mL）=[ C標準液÷(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V反總÷(V樣÷V樣總)÷T =0.7×(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) 肝脂酶（HL）活性（U/mL）=0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=總脂酶活性－HL C標準液：標準品濃度，500 μmol/L=0.5 μmol/mL；V反總：催化反應體系總體積，10+100+100=210μL=0.21 mL；V樣：加入催化反應體系中粗酶液體積，10μL；V樣總：粗酶液總體積，1mL=1000μL；T：催化反應時間，15 min。 2. 組織中LPL與HL活性計算 （1）按蛋白濃度計算 37℃中每毫克蛋白每分鐘內催化產生1μmol FFA。 總脂酶活性（U/mg pr） =[ C標準液÷(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V反總÷(Cpr×V樣)÷T =0.7×(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷Cpr 肝脂酶（HL）活性（U/mL） =0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷Cpr 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=總脂酶活性－HL （2）按樣本鮮重計算 37℃中每克樣品每分鐘內催化產生1μmol FFA。 總脂酶活性（U/g 鮮重） =[ C標準液÷(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T =0.7×(A總脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷W 肝脂酶（HL）活性（U/mL）=0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷W 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=總脂酶活性－HL C標準液：標準品濃度，500 μmol/L=0.5 μmol/mL；V反總：催化反應體系總體積，10+100+100=210μL=0.21 mL；V樣：加入催化反應體系中粗酶液體積，50μL=0.05 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：粗酶液蛋白質濃度，mg/mL；T：催化反應時間，15 min。 |
