測(cè)定意義 GOD(EC 1.1.3.4)廣泛存在于動(dòng)物、和植物中,催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并產(chǎn)生H2O2,是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一。 測(cè)定原理 GOD催化產(chǎn)生H2O2,過(guò)氧化物酶在有氧存在時(shí)催化H2O2分解產(chǎn)生的氧又將鄰聯(lián)茴香胺氧化生成有色物質(zhì),顏色深淺與葡萄糖氧化酶活性成線(xiàn)性關(guān)系。 試驗(yàn)中所需的儀器和設(shè)備 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水 試劑的組成和配制 提取液:液體×1瓶,4℃保存; 試劑一:液體×1瓶,4℃保存; 試劑二:液體×1瓶,4℃保存; 試劑三:液體×1支,4℃保存; 樣品測(cè)定的準(zhǔn)備 組織處理:稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿;8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。 血清(漿):直接檢測(cè)。 測(cè)定步驟 - 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至500nm,蒸餾水調(diào)零。
2、GOD檢測(cè)工作液的配制:用時(shí)將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中,充分混勻,待用。 3、測(cè)定前將GOD檢測(cè)工作液在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。 4、在EP管中加入10μL樣本和240μL工作液,立即混勻并計(jì)時(shí),立即取200µL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中,記錄500nm下20s吸光值A1和1min20s后的吸光值A2。計(jì)算ΔA=A2-A1。 GOD活力單位的計(jì)算 a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下 1、血清(漿)GOD活力的計(jì)算 單位的定義:每mL血清(漿)在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。 GOD(U/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=3333×ΔA 2、動(dòng)物組織GOD活力的計(jì)算 (1)按蛋白濃度計(jì)算 單位的定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。 GOD(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)÷T=3333×ΔA÷Cpr (2)按樣本鮮重計(jì)算 單位的定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。 GOD(U/ g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=3333×ΔA÷W V反總:反應(yīng)體系總體積,2.5×10-4 L;ε:氧化型鄰聯(lián)茴香胺摩爾消光系數(shù),7.5×103mol/L/cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。 b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下 1、血清(漿)GOD活力的計(jì)算 單位的定義:每mL血清(漿)在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。 GOD(U/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=6666×ΔA 2、動(dòng)物組織GOD活力的計(jì)算 (1)按蛋白濃度計(jì)算 單位的定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。 GOD(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)÷T=6666×ΔA÷Cpr (2)按樣本鮮重計(jì)算 單位的定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。 GOD(U/ g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=6666×ΔA÷W V反總:反應(yīng)體系總體積,2.5×10-4 L;ε:氧化型鄰聯(lián)茴香胺摩爾消光系數(shù),7.5×103mol/L/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。 |