實時熒光定量PCR檢測服務-上海信帆生物
更新時間：2020-03-11 點擊次數：1885次實時熒光定量PCR檢測服務-上海信帆生物
上海信帆生物提供RT-PCR實驗代測服務，檢測周期短，實驗操作人員技術成熟，誤差小，結果真實確認可靠。
一、服務介紹
實時PCR（real-time PCR），屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時間內DNA的增幅量為基礎進行DNA的定量分析。定量方式包括定量和相對定量?？蓹z測mRNA，microRNA，lncRNA和DNA水平的基因拷貝數變化。
二、服務流程
1、引物設計與合成
2、DNA/RNA抽提
3、反轉錄（針對RNA）
4、上機定量分析
三、客戶提供
1、全血、組織或細胞。細胞：細胞數>107，組織：總量>200mg，DNA或RNA樣品：總量>5ug
2、引物，或由信帆生物提供。
3、基因信息：目的基因名稱、物種和序列（或GenBank Accession Number）。
四、交付內容
實驗報告：詳細操作步驟
原始數據：擴增曲線圖，ct值
實時熒光定量PCR檢測服務所使用的熒光化學材料可分為兩大類,即熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR GreenⅠ為主要代表,是非特異性熒光化學材料。熒光探針包括TaqMan、分子信標、熒光標記引物、雜交探針等,屬于特異性熒光材料。
SYBR GreenⅠ是一種能夠與雙鏈DNA小溝結合的染料。在游離狀態下,SYBR GreenⅠ發出微弱的熒光,但是一旦與雙鏈DNA結合,其熒光強度大大增強。因此,一個反應發出的全部熒光信號與出現的雙鏈DNA量成正比,可以根據熒光信號檢測出PCR體系中的雙鏈DNA的數量。其優點是檢測方法簡單,通用性好,價格相對較低,是許多實驗室開展熒光定量實驗。SYBR GreenⅠ的缺點在于它能夠和所有的雙鏈DNA相結合,因此由引物二聚體、單鏈二級結構、非特異性擴增產物引起的熒光信號會影響定量的準確性。但可以通過優化PCR的反應條件、選擇設計良好的引物,來減少或去除引物二聚體和非特異性產物的產生;另外,也可以通過對擴增產物的溶解曲線進行分析來判斷熒光信號的真實性。
TaqMan探針技術是有美國Perkin Elmer(PE)公司研制的一種實時PCR定量技術,在PCR擴增加入一對引物的同時加入1個特異性的熒光探針,此熒光探針為一個30~45 bp的寡核苷酸,它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對,其5′端標記熒光發射基團,3′端標記熒光淬滅基團。當探針保持完整時,3′端淬滅基團抑制了5′端發射基團的熒光發射。但在PCR擴增中,模板變性后低溫退火,引物與探針同時與模板結合,在引物的介導下,沿模板向前延伸至探針結合處,發生鏈的置換,Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性將探針5′端連接的熒光發射基團從探針上切割下來,游離于反應體系中,從而脫離3'端熒光淬滅基團的屏蔽,接受光刺激發出熒光信號。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是相對應關系,且熒光強度同被釋放的熒光基團的數目也是正比關系,因此該技術可對模板進行準確定量。TaqMan探針技術特異性好、準確性高、假陽性低、重復性比較好。但是需要設計特異性的探針,因此成本較高。
分子信標技術是一種呈發夾結構的莖環狀雙標記寡核苷酸探針,環部與靶DNA序列互補,為15~35 bp;莖部是由互相配對的堿基組成,但與靶DNA無序列同源性,約8 bp。在探針的5′端和3′端分別標記熒光發射基團和熒光淬滅基團。當溶液中的模板與分子信標結合配對時,分子信標的構象改變成鏈狀使得熒光發射基團與淬滅基團分開,當熒光基團被激發時,就發出熒光信號。與探針互補的靶分子數量越多,熒光信號也就越強,從而實現了對目的基因的定量檢測。分子信標的方法優點是特異性強,熒光背景低。其缺點是設計困難,雜交探針不能*與模板結合,穩定性較差,價格高。
【儀器設備】
PCR擴增儀
電泳裝置
微量離心機
微量移液器（1～20ml和20～200ml）
0.5ml Eppendorf 管
紫外線觀察裝置及照相設備
2.2.2.3 操作程序
1．在無菌的Eppendorf管內加入以下反應物：
2．93℃ 反應2 min后開始以下循環：
93℃變性反應1 min；
50℃退火反應1 min；
72℃延伸反應3 min。
經過17～35循環后，zui后一個循環72℃增加5 min。循環結束后反應產物置于40℃保存。
3．取1～5ml反應產物走凝膠電泳，經溴化乙錠染色檢測擴增的情況。
2.2.2.4 應注意的問題及其解決方法
1．PCR反應條件的優化
要優化特定的PCR反應，有必要試用不同的反應組分和循環參數。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對反應結果的影響，從中大家可以得到一些線索以改進反應條件，提高PCR產量和/或特異性，一般情況下，只須改變一兩個參數就行了，如pH值和MgCl2濃度。表2-2給出了循環參數對PCR結果的影響。
表2-1 PCR各反應組分濃度對產物特異性和產量的影響
| 反應組分 | 提高產量 | 提高特異性 |
| 模板濃度 | 增加 | 減少 |
| 引物濃度 | 高至75 pmol | 低至15 pmol |
| 引物長度 | － | 增加 |
| dNTPs | 各1 mmol/L | 各20 mmol/L |
| Tris-HCl (10 mmol/L pH8) | pH高至10* | pH高至10* |
| MgCl2 | 高至4 mmol/L | 1.5 mmol/L |
| DMSO | － | 10%** |
| 甘油 | － | 2% |
| 甲酰胺 | － | 5% |
| Taq DNA聚合酶*** | 高至5U | 0.5U |
* 效果可能不可預測
** 添加10% DMSO時，Taq DNA聚合酶的活性會被抑制47%，因此反應加大Taq DNA聚合酶的用量（即5U）予以補償
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改變以提高PCR產物的特異性和/或產量的循環參數
| 反應條件 | 提高產量 | 提高特異性 |
| 循環數 | zui多35個 | 減至25個 |
| 變性* | 增至1 min | － |
| 引物退火** | 降至45℃ | 升至72℃ |
| 引物延伸*** | 在后期循環中延長 | 維持30s |
* 使用基因組DNA作模板時，開始幾個循環變性應于97℃進行
** 假定Tm值為60℃
*** 延伸時間依產物大小而定：1000bp的產物延伸30s即可，產物更長時，按每1000 bp延伸0.5 min計，在后期循環中增加延伸時間可以提高擴增效率
2．引物的設計
毫無疑問，引物的堿基組成，長度及其靶序列的同源性是決定PCR成敗的首要因素，選擇設計引物在一定程度上仍然要靠經驗，對于某一對引物而言尚無通用的規則可嚴，但應遵守以下原則：
（1）一般性原則：
①長度：15～30bp，其有效長度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38，否則PCR的zui適延伸溫度會超過Taq酶的*作用溫度（74℃），從而降低產物的特異性。
②G＋C含量：應在45%～55%之間，PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5～10度。引物長度小于20時，其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。
③ 堿基分布的隨機性：應避免連續出現4個以上的單一堿基。尤其是不應在其3’端出現3個的連續的G或C，否則會使引物在G＋C富集序列區錯誤引發。
④ 引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成發夾樣二級結構。
⑤引物之間：兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3’端的互補重疊。
⑥特異性：與非特異擴增序列的同源性應小于70%，或少于連續8個的互補堿基。
提供RT-PCR實驗檢測，實時熒光定量PCR實驗檢測服務
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