信帆分享:實驗達人做Western-blot成功的秘訣
更新時間:2017-02-09 點擊次數(shù):1528次信帆分享:網(wǎng)友做Western-blot成功的秘訣。上海信帆生物代做WB實驗,歡迎大家!
1. 提取,組織一定要切成小塊,可以用剪刀剪或刀切,剪碎后再提取,蛋白濃度能高出一倍來。
2. 研磨一定要在冰上進行,一般間斷研磨30分鐘就足夠了。
3. 離心,一般30分鐘。
4. 電泳,網(wǎng)上有人說膠要提前一天灌好,放一夜再用(有人說放冰箱里,有人說室溫),結果發(fā)現(xiàn)室溫放置后第二天上樣孔處就干了,變形不好上樣;zui關鍵的是,我發(fā)現(xiàn),當天新灌的膠走出來的條帶清楚,而提前一天做的則走出來條帶模糊;所以建議大家還是當天做膠比較好。我一般是到實驗室后,把制冰機打開,大冰凍離心機打開,然后開始做膠,把分離膠灌好以后,開始提取蛋白,1小時左右開始離心了,再灌濃縮膠;這樣膠大約有一個小時的凝固時間,足夠了。 要注意的是,灌完分離膠加水的時候,要貼玻璃板的一個角加水,否則膠的局部會受到影響,影響電泳條帶筆直度。
5. 電泳緩沖液可以重復用; 做膠的試劑買分析純的一般試劑使用一點問題都沒有,不用買進口的很貴的所謂試劑; 我的蛋白分子量分別是40 和170,我分離膠用10%,濃縮用4%,一點問題都沒有,都走的很好,分的很開。
6. 轉膜,我一般電濕轉,80 V 電壓轉2小時,即使分子量170 kDa 的蛋白也能轉得過去,不用過夜的轉法,節(jié)省時間;我的40 kDa 和170 kDa 蛋白一起轉,沒有問題。
7. 封閉,我用5%奶粉,的,室溫下?lián)u晃封閉1小時,太長了沒必要,更不一定需要過一夜。
8. 一抗,我用的是Santa的一抗,1:400稀釋(10 ul/4 ml 牛奶),用雜交袋搖晃雜交1小時,沒必要過夜;用雜交袋很省抗體;抗體不重復用;但是我當天重復用兩次,效果也還可以;雜交的時候要保持蛋白面超上。
9. 洗一抗,我是室溫下洗10 X 3次。
10. 二抗,我用1:2000,室溫雜交50分鐘,也是用雜交袋,6 ml 左右,我的膜比。
11. 再洗二抗,同前。
12. 顯色,我是把膜蛋白面朝上放在培養(yǎng)皿上,然后往上面滴顯色AB液,反應2-3分鐘,然后不擦干直接放暗盒里,上面蓋層保鮮膜,用筆畫出膜的邊緣,以免暗室內找不到膜的位置。
13. 洗片,我用培養(yǎng)皿裝顯影劑,節(jié)省啊,然后撈出后用水沖一下,再放進定影液里。
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