常用elisa試劑盒操作要點
更新時間:2017-02-08 點擊次數:1782次elisa試劑盒操作步驟包括樣本的采集和保存、試劑和樣本的平衡、加樣、溫育、洗滌、顯色、比色、結果判定和結果報告。環節眾多,任一環節操作不當,皆可影響測定結果。因此,必須重視各環節操作,掌握控制要點,方能保證檢測結果準確可靠。
1 樣本的采集和保存
作為激素和治療藥物測定的樣本應考慮采集時間及體位等因素影響,可的松和促激素清晨會有一峰值出現;生長激素、促黃體激素、促卵泡激素均以陣發性方式排放;從臥位變為站位時,腎素活性將明顯增高;藥物濃度監測應根據藥代動力學選擇合適時間采集樣本。
外源性干擾因素對檢測結果的影響,溶血、脂血、細菌污染、血液標本收縮不充分、存貯過久、反復融凍等。盡量使用玻璃試管抽血,慎用塑料試管盛血,因聚乙烯易吸附抗原和抗體,影響檢測結果。
2日內測定血液樣本,,置2℃—8℃冰箱保存;2日至7日內測定,置2℃—8℃冰箱保存;7日以上測定,置-20℃以下冰箱保存。
2 試劑和樣本的平衡
試劑和樣本在測定前應先放置室溫(20℃—25℃)平衡20分鐘以上,以保證后續操作步驟中抗原抗體足夠反應溫度。
3 加樣本及試劑
應正確使用移液器和試劑滴瓶。移液器應定期校準和維護,加樣本時,應加在微孔下1/3處,不可擦劃底部、沖起泡、加到微孔上緣或濺出。滴加試劑(包括抗原、酶結合物及顯色劑)時,應搖勻試劑,先棄去瓶口1—2滴,然后垂直、均勻加入微孔。
4 溫育
溫育是ELISA操作中的關鍵步驟。國產試劑通常采用37℃30分鐘和37℃60分鐘兩種方式。為保證溫度均一,抗原抗體反應充分,宜采用水浴方式加熱。如用孵箱,可內置一方盤,底襯紗布,加入適量水,微孔板放入其中溫育。
5 洗滌
ELISA為異相固態方式檢測,所以分離結合和游離酶結合物是一個重要環節,洗滌即是達到這樣一個目的。洗板質量直接影響檢測結果,所以需重視洗板質量。現在新推出的洗板機大多增設有兩點吸液、底部沖洗和振蕩等功能,可以充分保證洗板質量。手工洗板時,應嚴格按照試劑說明書操作,洗滌不足和洗滌過度都將影響檢測結果。
6 顯色
ELISA顯色常用TMB和H2O2作為顯色劑,顯色時間37℃15—20分鐘,顯色過程可不避光。使用前應檢查顯色劑是否變質,嚴格控制顯色時間。顯色劑質量檢查,在玻片、試管或eppendorf管中滴入顯色劑A和B各一滴,若不變色,則質量可靠。繼續滴入一滴酶結合物,搖勻后幾分鐘內溶液出現藍色,既可檢查顯色劑質量,又可檢查酶結合物質量。
7 比色
加終止液終止顯色反應后,通常要求30分鐘內用酶標儀完成比色測定。采用主波長450nm測定,可有效避免微孔上的劃痕、指印及其它附著物對光的干擾。另外,加終止液后,應盡快比色,因為呈色深的微孔易出現沉淀致吸光度下降明顯。
8 結果判斷和結果報告
判斷結果時,要正確按照試劑盒要求設置計算參數,內外對照值均應在控,才能判定測定結果有效。對于少見模式和臨界值附近結果應堅持復核