上海信帆生物 :TUNEL檢測選擇指南
更新時間：2016-06-06 點擊次數：913次細胞凋亡一直都是細胞生物學研究的熱點，這個復雜的過程涉及多條通路，可以用多種方法在不同的階段進行檢測。細胞凋亡晚期，細胞核發生形態變化、染色質凝聚、核膜降解、DNA片段化。
TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）介導的缺口末端標記法）是檢測DNA片段化的成熟方法，自1992年發表以來經過不斷改進，縱橫實驗室逾20年，至今仍然是廣泛采用的凋亡檢測方法，這是因為TUNEL能夠與其他細胞學技術很好的契合。比如，使用TUNEL分析進行凋亡研究有一個好處，研究人員在TUNEL法標記細胞之后，在直接檢測和定位凋亡信號的同時，還可以通過抗體在同一個樣本上檢測細胞表面和細胞內的生物學指標。
TUNEL的基本原理：DNA斷裂時會產生大量的粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將生物素或熒光素或digaoxin標記的dUTP摻入到DNA的3'-末端，可通過一定的顯色系統使之顯示出來。過去，TUNEL算得上是個值得“用心摸索”的試劑盒，因為有點技術難度。如今市場上的TUNEL檢測產品有了哪些改進和新選擇呢？
考慮通透性和標記
TUNEL檢測的一個關鍵要素是把握好細胞透化的時間。透化的目的是通透細胞膜和核膜，通俗說就是在膜上打孔，讓反應試劑得以充分進入細胞核進行反應，提高檢測效果。門開小了大家俬不好進場，若透化不足可能檢測不到凋亡的特征，造成假陰性。可開孔太過又影響形態，透化時間太長還容易脫片。
DNA的標記是另一個重要的影響因素。標記分子太大則不利于TdT將其摻入DNA片段。早期的分析中dUTP通常用生物素或熒光素標記，由于熒光基團的“大塊頭”，使得其標記的dUTP摻入DNA的效率要低于預期。后來改進為利用Br-dUTP來取代生物素或熒光素標記的dUTP，因為溴分子比熒光素、生物素等標記物要小得多，因此Br-dUTP更容易被摻入凋亡細胞的DNA片段中，再經過Br-dUTP抗體識別、以及抗體上偶聯的生物素或熒光素放大或顯色，使得zui后的檢測信號也更強。但是，Br-dUTP要用抗體檢測，要求嚴謹的反應條件。
更好的選擇是EdUTP，這種以炔烴基團（一種小分子基團）修飾的dUTP比Br-dUTP更小，更容易被TdT摻入到DNA末端。更妙的是，EdUTP的檢測不需要經過抗體，而是通過一步高度特異性的click反應（一種銅催化的疊氮化物與炔烴之間的反應），將摻入DNA的EdUTP上的炔烴基團，與疊氮化合物（偶聯生物素或熒光素）共價連接，再借助疊氮化物上的生物素或熒光標記，可實現靈敏的TUNEL檢測。與BrdU抗體（分子量約為150 kDa）相比，這個疊氮化物的大小僅為1%（分子量<~1000 Da），通透性要好得多。
click技術的優勢在于疊氮化物和炔烴都是極小的惰性基團，因此，只需要溫和的固定和透化條件，即可達到讓試劑充分滲透進入細胞核。同時，高度特異的click反應可實現更低的背景干擾，和更穩定的共價結合產物，從而更好地檢測凋亡細胞。此外，升級版的Click-iT Plus技術無需銅的參與，染料兼容性更廣泛，在多色檢測中表現更出色。
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