上海信帆生物：膠體金標記蛋白A技術攻略
更新時間：2016-04-28 點擊次數：1348次
PAg復合物制備方法簡便，作為第二抗體，無種屬特異性，可以免去不同種屬動物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg 復合物與包埋劑和細胞成分都極少發生非特異性的交互作用，蛋白A和金粒間非共價的結合特性既不影響蛋白A的活性，又能保持高度的穩定性，PAg復合物分子zui小易于穿透組織。PAg復合物的原液在4℃可保存達一年之久。電鏡水平的PAg染色法 PAg法在電鏡技術的應用原則是二步標記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區別于一般膠體金免疫染色在：①須1%卵白蛋白-PBs (pH7.4)或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris緩沖液(pH7.4)來封閉非特異性的結合部位，而不是采用羊或其它的動物的正常抗血清，因為PAg復合物能夠與正常血清組中的Ig結合，從而給出假陽性結果;②在應用*抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復合物孵育前的準備時，應用的PBS或TBS的pH應變更為pH8.2.其它可參照本節中包埋后染色法進行。
一、液體配制：
1、膠體金稀釋液配方：
(PH=8、2)的0.02mo1/L Tris TBS緩沖液，加入試劑級卵清白蛋白至1%。{免疫電鏡按1：20-50稀釋，淡紅色為適宜稀釋液，膠體金稀釋后應于當天使用，未用完的應該丟棄。(免疫膠體金說明書)｝
2、清洗液：
0、5mol/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液：Tris，60.57g，1mol/L Hcl約420m1，調pH值至7.4，zui后加雙蒸水至1000m1，此為儲備液。
0、05mo1/L Tris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g;0.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液100m1;加雙蒸水至1000m1，調pH值至7.4.
0、02mo1/LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g;o.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液40m1，加雙蒸水至l000m1，調pH值至8.2.
3、H2O2的配制:3% H2O2
4、8%過碘酸鈉水溶液
5、封閉液：
前封閉液：1%卵白蛋白—0.05mo1/LTris緩沖液(pH7.4);
后封閉液以及膠體金稀釋液：1%卵白蛋白—0.02mo1/LTris緩沖液(pH8.2)，后封閉為膠體金結合作準備。
二、具體操作:
(一)包埋：
常規電鏡制樣，樣品只需要戊二醛固定，不需要鋨酸后固定。丙酮梯度脫水時70%的丙酮中沒有添加染色劑。樣品于37度烘箱中固化。
(二)切片：
超薄切片厚50～70nm左右，載于300網孔的鎳網上。
(三)抗原修復：
1、置1%H2O2內10min至1h(視樹脂的硬度和切片的厚度而定)，以去鋨酸和增進樹脂穿透性，有利抗體進入。如切片很薄或于低溫包埋時，此步可省略。操作時，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網的載片面輕浮于液滴上。對中樞神經系統切片，有主張以1%過碘酸鉀(KIO4)代替H2O2的。
(同時用8%過碘酸鈉水溶液代替雙氧水，室溫5～25分鐘以及丙酮對環氧樹脂進行溶解。看三者那個效果)
2、雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次浮于液滴上清洗，第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網面沖洗，水流應有適當壓力，但不宜過高強，用濾紙在網緣將水吸干。(0.05mo1/L TBS pH7.4洗5min×3次?)
三、封閉以及免疫反應：
1、載有超薄片的鎳網或金網浮于1%卵白蛋白-TBS(7.4)液滴上，室溫約1h，阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。
2、載網直接移至*抗血清液滴上(抗體稀釋度較常規免疫組化低l倍)，在室溫孵育2h或4℃18～24h.
3、0、05mo1/L TBS pH7.4，洗5min×3次。0.02mo1/L TBS PH8.2，洗5min×3次。1%卵清白蛋白0.02mo1/L TBS(8.2) 37℃孵育l h，再次阻斷非特異性吸附，吸去多余液體，不洗。
4、將PAg原液稀釋10～20倍(1：30～1：100，淡紅色為適宜稀釋液)，載網浮于該液滴上，室溫孵育10min至1h(37℃孵育2h?)。
5、0、02mo1/L TBS pH8.2，洗5min×3次。0.05mo1/L TBS pH7.4，洗5min×3次。zui后切片浸于0.05m01/L TBS pH7.4緩沖液中，送電鏡室處理(含2%戊二醛及3%多聚甲醛的TBS液固定30分鐘?)。
四、電子染色以及電鏡觀察
1、5%醋酸鈾(雙蒸水配制)染5min，然后用雙蒸水洗。
2、枸櫞酸鈾(或醋酸鉛)染色5min，雙蒸水洗凈。
3、H-600透射電鏡觀察。
五、免疫膠體金試驗成功的要求
抗體高度特異性和親和力以及被檢組織內抗原含量高;標本的前處理和染色也至關重要。
取消鋨酸后固定，聚合溫度不宜高于45度，可以選用37度12小時，45度48小時作為聚合溫度。試驗全過程應保持網面的濕潤。緩沖液要清潔，用新鮮配制的或經微孔濾紙過濾后使用。
染色前所用器皿必須清潔干凈且，并用雙蒸水沖洗三遍，染色程序中的洗滌必須充分，以減少背景染色。尤其雙重免疫標記的切片染色時，*次金標二抗孵育后必須充分洗滌，以不影響第二次金標二抗的反應結果。摘自:賈云香，卓夏陽，顧云娣。雙重膠體金標記的免疫電鏡技術。江西醫學院學報，2003,43(4):22-24
將免疫組織化學技術與電子顯微鏡技術相結合，則可以利用電子顯微鏡高分辨率的優點，在超顯微結構水平定位細腦內的特異性抗原。為疾病的病因、發病機理、組織來源等方面的探索研究，為提高疾病的認識與診斷提供可靠的手段。
六、附錄
1、試劑配制：
(1)4%多聚甲醛一0.01%戊二醛溶液：多聚甲醛4g，0.2m01/L二甲砷酸鈉緩沖液(內含0.2mol/L蔗糖，0.4mmo1/L CaCl2)50 m1，20%戊二醛40ul，雙蒸水加至100m1.
(2)0、5mol/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液：Tris，60.57g，1mol/L Hcl約420m1，調pH值至7.4，zui后加雙蒸水至1000m1，此為儲備液。
(3)0、05mo1/L Tris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g;0.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液100m1;加雙蒸水至1000m1，調pH值至7.4.
(4)0、02mo1/LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g;o.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液40m1，加雙蒸水至l000m1，調pH值至8.2.
(5)0、5mo1/L，Triton-Tris緩沖生理鹽水：Tritonx-100 l0m1;0.5mo1/L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液100m1，加雙蒸水至l000m1，調pH值至7.4.
2、具體步驟:
(1)0、05mo1/L TBS(pH7.4)洗5min×3次。
(3)1：5正常羊血清(0.05mo1/L TBS PH7.4)37℃孵育l h，阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。
(4)特異性一抗(抗體稀釋度較常規免疫組化低l倍)室溫孵育24h.
(5)0、05mo1/L TBS pH7.4，洗5min×3次。
(6)0、02mo1/L TBS PH8.2，洗5min×3次。
(7)1：5正常羊血清(0.02mo1/L TBS pH8.2)37℃孵育l h，再次阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。
(8)生物素化膠體金標記二抗(原液)37℃孵育2h.
(9)0、02mo1/L TBS pH8.2，洗5min×3次。
(10)0、05mo1/L TBS pH7.4，洗5min×3次。
(11)zui后切片浸于o.05m01/L TBS pH7.4緩沖液中，送電鏡室處理。
無DNA酶的胰RNA酶 將胰RNA酶溶解于10mmol/LTris-Hcl(PH7.5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的濃度，與100度加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份-20度保存。
3、病毒液體的膠體金技術
(自：傅倉生，膠體金免疫電鏡技術用于煙草花葉病毒的檢測，植物病理學報，VoL.24，No.4，353—355)1.3.1 外標記標本制備： (1)以帶膜銅網蘸取純化病毒懸液，PBS沖洗。(2)在相應的抗血清中室溫孵育20分鐘，PBS沖洗。(3)在PAg(1：50稀釋)中室溫孵育20分鐘，PBS沖洗。(4)1%醋酸鈾負染，H500電鏡觀察，拍照。
內標記標本制備： (1)以感染煙草花葉病毒的普通煙葉的試料，電鏡常規制樣，超薄切片。(2)在TMV抗血清中室溫孵育l小時，PBS沖洗數次。(3)在PAg(1：50稀釋)中室溫孵育1小時，PBS沖洗數次，三蒸水沖洗數次。(4)醋酸鈾一檸檬酸鉛雙染色，H500電鏡觀察，拍照。
(自：翟雷，樸曉萍，潘萍等。微生物學免疫學進展，1995，24(3)：17-19.免疫膠體金試劑的制備及應用膠體金免疫電鏡技術檢測戊型肝炎病毒)取樣品100 ul分別于微量離心管，各加100 ul鼠抗HEV單克隆抗體(1：500一1000稀釋)，混勻， 37℃溫箱作用60min，雙蒸水充滿管，13000 rPm離心30 min，棄上清。沉淀用100 ul雙蒸水懸浮，加l00ul膠體金標記免抗鼠IgG，溫勻，置37℃溫箱作用60 min.雙蒸水充滿管，13000rPm離心30min，棄上清，沉淀用l00ul雙蒸水懸浮，滴于鍍膜銅網，干后3%PH7.4的PTA負染，電鏡觀察。
(自：滴一滴NDV于銅網上，室溫吸附15分鐘，然后用0.1%的PBS洗5次，吸去余液;加一滴金標抗體于銅網上，37度作用20分鐘，PBS洗5次，吸去余液，然后用磷鎢酸負染5分鐘，干燥后電鏡觀察。
(自：梁紅，譚紅英，蔡景霞等。蛋白A膠體金免疫電鏡負染技術檢測脊髓灰質炎病毒和SV40病毒，中華微生物和免疫學雜志，1998，9(2)：111-112) 取抗原抗體各50UL在血凝板孔中37度，45分鐘。加OD值為0.2膠體金50UL，37度，45分鐘。取抗原抗體膠體金混和物50UL，于銅網，室溫30分鐘。膠體金緩沖液洗兩次，雙蒸水洗一次，磷鎢酸負染，電鏡檢查。
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