上海信帆生物：免疫組化與抗原修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用
更新時(shí)間：2016-04-22 點(diǎn)擊次數(shù)：1229次福爾馬林固定時(shí)，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時(shí)，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡(luò)，也導(dǎo)致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當(dāng)部分的抗原不能與抗體很好是進(jìn)行反應(yīng)。因此，抗原修復(fù)也是影響免疫組化染色結(jié)果的基本因素。抗原修復(fù)(Antigen retrieval ，AR)技術(shù)，建立在Fraenkel-conrat等人[1]一系列生物化學(xué)研究，經(jīng)1991年shi等人[2]發(fā)展。抗原修復(fù)是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(xué)(IHC)前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)過(guò)程。抗原修復(fù)能zui大程度地恢復(fù)在制片等過(guò)程中損失的抗原性，使原來(lái)認(rèn)為不能在石蠟切片上進(jìn)行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結(jié)果，成為一種有效的補(bǔ)救措施。本文的目的是概述AR-HIC的發(fā)展、應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)化。
一、 AR技術(shù)
加熱AR技術(shù)
微波加熱方法. 在傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法,經(jīng)脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧(化)物酶，石蠟切片經(jīng)蒸餾水沖洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸餾水、緩沖液、金屬鹽液、尿素等，蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘(注意防止切片干躁)。有時(shí)在加熱5分鐘后，間隔1分鐘，再加熱5分鐘(在*個(gè)5分鐘后檢測(cè)液體高度)。加熱后，從微波爐取出塑料Coplin缸，冷卻15分鐘。片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘，才進(jìn)行IHC染色。為了保持一致的加熱條件，必須設(shè)定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號(hào)的Coplin缸 ，按照不同的抗體設(shè)定不同的加熱時(shí)間，盡可能的建立標(biāo)準(zhǔn)的加熱條件。
微波(MW)加熱過(guò)程如下：在盒內(nèi)放入200ml檸檬酸緩沖液(PH6.0±0.1)，并蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰;將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩沖液中，有作者提供做免疫組化時(shí)采用微波爐中等功率800W[3]，微波爐選用解凍檔的國(guó)產(chǎn)家用微波爐(根據(jù)目前的研究,建議用醫(yī)用微波爐)，中檔繼續(xù)處理10-20分鐘;取出微波塑料缸冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次，之后用PBS(PH7.2-7.4)沖洗兩次，每次3分鐘。
盡管有少數(shù)作者[4]認(rèn)為經(jīng)高溫后冷卻這一步省略。在我們觀點(diǎn)，15分鐘的冷卻必須的幾點(diǎn)理由：1、如這一步省略，對(duì)于有些抗體而言，會(huì)降低AR-IHC染色強(qiáng)度。2、突然從高溫到低溫可導(dǎo)致組織片掉片。3、可能引起形態(tài)學(xué)的變化。
單純加熱方法. 將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中,置電爐(600W)上加熱至沸騰，并持續(xù)10min 。Shi等人[2]用單純加熱方法與微波加熱方法比較IHC染色強(qiáng)度，顯示兩種方法導(dǎo)致相同的染色強(qiáng)度。
高壓加熱方法. Shin等人[5]發(fā)展了含水高壓鍋煮沸方法，來(lái)增強(qiáng)福爾馬林固定的腦組織tau蛋白免疫反應(yīng)性。將切片連同檸檬酸緩沖液放入高壓鍋內(nèi)，加熱至產(chǎn)生噴氣，并持續(xù)2min，壓力鍋離開(kāi)熱源，加熱長(zhǎng)短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋到壓力鍋離開(kāi)熱源總時(shí)間在5-8分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)使染色背景加深。現(xiàn)試劑公司提供的大多數(shù)抗體都建議使用高壓鍋煮沸方法，這幾年的實(shí)踐表明，采取此方法可避免假陽(yáng)、陰性，使IHC染色效果更佳。
非加熱AR技術(shù)
非加熱AR技術(shù)包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化學(xué)的方法來(lái)打斷醛鍵，修復(fù)抗原。
胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05%或0.1%PH7.8的無(wú)水氯化鈣水溶液中，溶解即可;或由邁新提供的0.125%的液體胰酶。將切片放入濕盒內(nèi)37oC溫箱中消化18-20分鐘。
胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4%的胃蛋白酶;
鏈霉蛋白酶消化法 . 將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，濃度為o.1%，消化時(shí)間20min。
抗原修復(fù)的方法選擇，關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對(duì)免疫組化染色效果有很大影響。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。對(duì)某些細(xì)胞內(nèi)抗原(如Fas、Bax、FⅧ等)和細(xì)胞間質(zhì)抗原(如Laminin、CoIV等)則需要用酶消化法處理切片。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說(shuō)來(lái)，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細(xì)胞間抗原的消化。工作中要認(rèn)真參照抗體說(shuō)明書指示進(jìn)行消化酶的選擇，這樣針對(duì)性更強(qiáng)，標(biāo)記效果更理想。
總之,以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩(wěn)定, 高壓加熱方法效果優(yōu)于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對(duì)修復(fù)效果無(wú)任何影響，而PH值則影響。緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。前人的研究表明，溫度高修復(fù)時(shí)間短[6]。解放軍第251醫(yī)院根據(jù)病理診斷、鑒別診斷和研究的實(shí)際需要，在抗原修復(fù)方法規(guī)范研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)上，創(chuàng)用了胰蛋白酶—尿素聯(lián)合消化技術(shù)、鹽酸水解暴露抗原技術(shù)和MW—表面活性劑Triton X—100(MW—TX)修復(fù)抗原技術(shù) [7] 。抗原暴露或抗原修復(fù)方法較多，其中發(fā)MW—枸櫞酸緩沖液使用較多，效果。MW修復(fù)抗原的方法是石蠟切片脫蠟、水洗后放入修復(fù)液中，用250W的輸出功率2X5min，待冷卻至室溫按常規(guī)處理。目前AR過(guò)程已成功應(yīng)用在BioTek全自動(dòng)免疫組化染色儀中。
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