上海信帆生物：?jiǎn)渭?xì)胞凝膠電泳的操作流程與注意事項(xiàng)
更新時(shí)間：2016-04-20 點(diǎn)擊次數(shù)：1665次單細(xì)胞凝膠電泳(又名彗星實(shí)驗(yàn))的操作流程主要包括單細(xì)胞懸液的制備、凝膠板制備、細(xì)胞裂解與解旋、電泳與中和、染色和觀察等步驟。本文總結(jié)了單細(xì)胞凝膠電泳操作步驟和注意事項(xiàng)，希望對(duì)初入實(shí)驗(yàn)的同學(xué)有幫助。
1、分離制備單細(xì)胞懸液：
(1)體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化，zui后用PBS懸浮吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞要計(jì)數(shù)，具體的量我前邊已經(jīng)說(shuō)過(guò)。
(2)體內(nèi)臟器細(xì)胞：處死動(dòng)物，取出臟器，于hanks’液中制備成單個(gè)細(xì)胞懸液。
2、膠板制備：
(1)取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。蓋玻片推勻，不能有氣泡，4度凝固5至8分鐘。
(2)水平取下蓋片，取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細(xì)胞懸液(約400個(gè)細(xì)胞)混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4度凝固5至8分鐘。
3、細(xì)胞裂解與電泳：
(1)將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小時(shí)。
(2)取出膠板，用雙蒸水浸沒(méi)漂洗后放入電泳槽中，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。
(3)玻片水平放置陽(yáng)附近，4℃電泳20到25分鐘(25V，300mA)。可在電泳槽周?chē)颖鶋K以保持低溫。
4、中和與染色：
(1)電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中，每次10分鐘，共中和3次，每次要更換中和液。zui后晾干。
(2)取出膠板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗處染色5到10分鐘。
(3)蒸餾水漂洗2次，每次5分鐘。
稍晾干，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察。
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