上海信帆生物：膠體金標記實驗的操作方法與步驟
更新時間：2016-04-20 點擊次數：1427次膠體金標記實驗的實驗過程主要包含以下步驟：膠體金標記蛋白的制備及其與膠體金之間的用量比例的確定、膠體金和蛋白的結合、膠體金標記蛋白的純化與質量檢測等。
1、蛋白質的處理：膠體金標記蛋白的制備
膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質的等電點時，則會聚集而失去結合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質的分子量等都影響膠體金與蛋白質的結合。
(1)待標記蛋白溶液的制備 將待標記蛋白預先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h，去除聚合物。
(2)待標膠體金溶液的準備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調膠體金液的pH值。標記IgG時，調至9.0;標記McAb時，調至8.2;標記親和層析抗體時，調至7.6;標記SPA時，調至5.9～6.2;標記ConA時，調至8.0;標記親和素時，調至9～10.
由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調節pH時，采用精密pH試紙測定為宜。
由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應先對低離子強度的水透析。必須注意，蛋白質溶液應澄清無細小微粒，否則應先用微孔濾膜或超速離心除去。
一般情況下應避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因為它們都可吸附于顆粒表面而減弱膠體金對蛋白質的吸附。
2、蛋白質zui適用量的選擇：膠體金與標記蛋白用量之比的確定
(1)根據待標記蛋白的要求，將膠體金調好pH之后，分裝10管，每管1ml.
(2)將標記蛋白(以IgG為例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml～50µg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。
(3)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結果。
(4)結果觀察，對照管(未加蛋白質)和加入蛋白質的量不足以穩定膠體金的各管，均呈現出由紅變藍的聚沉現象;而加入蛋白量達到或超過zui低穩定量的各管仍保持紅色不變。以穩定1ml膠體金溶液紅色不變的zui低蛋白質用量，即為該標記蛋白質的zui低用量，在實際工作中，可適當增加10%～20%。
將待標記的蛋白質儲存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質5～40ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設一管不加蛋白質的對照管，5分鐘后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混勻后靜置2小時，不穩定的金溶膠將發生聚沉，能使膠體金穩定的zui適蛋白量再加10%即為標記蛋白量。
3、標記：膠體金與蛋白質(IgG)的結合
將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續攪拌10min，加入一定量的穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。常用穩定劑是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量：5%BSA使溶液終濃度為1%;1%聚乙二醇加至總溶液的1/10.
在接近并略為高于蛋白質等電點的條件下標記是比較合適的，在此情況下蛋白質分子在金顆粒表面的吸附量zui大。
下述標記步驟zui為常見：
①用0、1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調節金溶膠至所需pH(標記SPA時調到pH6.0)。
②于100ml 金溶膠中加入標記量的蛋白質溶液(體積為2～3ml)，攪拌2～3分鐘。
③加入5ml1%PEG20000溶液。
④于10000～100000g離心30～60分鐘(根據粒徑大小選擇不同離心條件)，小心吸去上清液(切忌傾倒)。
⑤將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復，濃度以 A1cm/540nm=1.5左右為宜，以 0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4℃保存。
⑥包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G-200柱進行凝膠層析分離純化，以含 0.1%BSA的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2，以A蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0.
4、膠體金標記蛋白的純化
(1)超速離心法：根據膠體金顆粒的大小，標記蛋白的種類及穩定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。
用BSA做穩定劑的膠體金—羊抗兔IgG結合物可先低速離心(20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min)20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結合物用6 000g，4℃離心1h;20nm～40nm膠體金結合物，14 000g，4℃離心1h.仔細吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3)，將沉淀重懸為原體積的1/10，4℃保存。如在結合物內加50%甘油可貯存于-18℃保存一年以上。
為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結合物再進一步用10%～30%蔗糖或甘油進行密度梯度離心，分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結合物。
(2)凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩定劑的膠體金蛋白結合物的純化。將膠體金蛋白結合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/5～1/10.再經1 500r/min離心20min.取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝膠S-400)層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm，加樣量為床體積的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脫(內含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG標記物)，流速為8ml/h.按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時略混濁，內含大顆粒聚合物等雜質。繼之為純化的膠體金蛋白結合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，zui后洗脫出略帶黃色的為標記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結合物過濾除菌、分裝，4℃保存。zui終可得到70%～80%的產量。
5、膠體金蛋白結合物的質量鑒定
(1)膠體金顆粒平均直徑的測量：用支持膜的鎳網(銅網也可)蘸取金標蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復染后觀察。計算100個金顆粒的平均直徑。
(2)膠體金溶液的OD520nm值測定：膠體金顆粒在波長510nm～550nm之間出現zui大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA，0.02%NaN3)將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋，OD520=0.25左右。一般應用液的OD520應為0.2～0.4。
(3)金標記蛋白的特異性與敏感性測定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法(MF-IGSSA)。將可溶性抗原(或抗體)吸附于載體上(濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜)，用膠體金標記的抗體(或抗原)以直接或間接染色法并經銀顯影來檢測相應的抗原或抗體，對金標記蛋白的特異性和敏感性進行鑒定。
本文詳述了膠體金標記蛋白的操作步驟，在以上標記的操作步驟中需要注意，所有溶液中均不可含雜質微粒，可選用高速離心或微孔濾膜進行預處理。
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