免疫組化代測之教你完成石蠟切片制作
更新時(shí)間:2015-08-31 點(diǎn)擊次數(shù):5264次1.烤片
烤片的目的是將帶有蠟的組織切片牢固地黏在載玻片上,以免染色過程中切片脫落。切片在56~60℃的恒溫箱中至少放置1小時(shí)才能達(dá)到此目的,但是,通常的烤片溫度為;8~60℃,時(shí)間為2~6小時(shí)。由于高溫干燥可加速組織中抗原的氧化,因此高溫烤片對抗原有破壞作用。
2.脫蠟和水化
分別在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15~30分鐘,以脫掉組織中的蠟。但是,進(jìn)人組織中的二甲苯不能與水溶性染色液相溶,故需進(jìn)一步通過下行梯度乙醇把組織中的二甲苯逐步替代出來。切片在100%乙醇工、Ⅱ中分別浸泡5分鐘,95%、90%、80%和70%乙醇中分別浸泡2分鐘,PBS漂洗3次,每次3分鐘,置蒸餾水中待用。
3.抗原修復(fù)
上海信帆生物科技公司憑借的生物技術(shù)和嚴(yán)格的質(zhì)量管理體系,專業(yè)代做免疫組化實(shí)驗(yàn) ,雄厚的技術(shù)力量做基礎(chǔ),專業(yè)團(tuán)隊(duì)做后盾,對免疫組化 提供100%的率熱情的技術(shù)服務(wù)。
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4.細(xì)胞膜打孔
切片置于0.1%~0.3%TritonX-100中,室溫浸泡25分鐘,PBS沖洗3次,每次5分鐘。TritonX-100為去污劑,其脂溶性可使細(xì)胞膜穿孔,增加細(xì)胞膜對抗體的滲透性。檢測細(xì)胞膜抗原時(shí)可免去此步驟。
5.滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素
6.非免疫血清封閉
抗體能被組織切片中富有電荷的膠原和結(jié)締組織成分吸附。從而導(dǎo)致背景著色,為了防止這種現(xiàn)象發(fā)生,在特異性抗體處理切片之前,選擇與二抗種屬相同的非免疫血清封閉電荷,阻止一抗與之結(jié)合,抑制非特異性背景著色。常用方法是用2%~10%羊血清或2%~5%牛血清白蛋白在室溫下作用10~30分鐘。但應(yīng)注意此種結(jié)合不牢固,所以不要沖洗,傾去余液直接加一抗。SABC或SP免疫組織化學(xué)試劑盒中常配有非免疫血清。
7.*抗體孵育
滴加特異性一抗于切片上,4℃孵育24~48小時(shí),或室溫孵育過夜,也可在37~C孵育1~2小時(shí)。之后,用PBS沖洗3次,每次5分鐘。一抗分為多克隆抗體和單克隆抗體。多克隆抗體的抗原專一性較差,非特異性反應(yīng)較明顯,效價(jià)不太穩(wěn)定。但多克隆抗體制備簡便,價(jià)格低廉,抗體效價(jià)較高,稀釋度一般在1:100~1000之間,高者可達(dá)1:數(shù)萬。
利用單克隆抗體制備技術(shù)制備的單克隆抗體特異性強(qiáng),無交叉反應(yīng),質(zhì)量和效價(jià)穩(wěn)定,非特異性反應(yīng)較少,標(biāo)記結(jié)果可靠,在應(yīng)用中有更多的*性。但單克隆抗體制備復(fù)雜,價(jià)格昂貴,抗體效價(jià)較低,稀釋度在1:50~100。抗體的選擇是開展免疫組化染色zui重要環(huán)節(jié)之一。市場銷售的一抗大部分來源于國外,生物試劑廠家各異,因此,對購入的抗體首先要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測。試劑公司在銷售抗體時(shí)附有說明書,包括抗體的來源、免疫球蛋白的亞類、單抗或多抗、使用稀釋度、使用流程和注意事項(xiàng)、洗滌時(shí)緩沖液的適宜離子強(qiáng)度和pH值等。市場銷售的一抗分為即用型和濃縮型兩種,對前者抗體的效價(jià)無需摸索,但對于濃縮型一抗,則應(yīng)摸索出*的工作效價(jià),抗體濃度過高或過低都將可能出現(xiàn)陰性結(jié)果,應(yīng)該以一個(gè)適當(dāng)?shù)南♂尪鹊玫?的抗原染色強(qiáng)度和zui低的背景著色。稀釋特異性抗體常用含1%~3%非免疫血清的PBS,需現(xiàn)配現(xiàn)用,稀釋后的一抗存放時(shí)間不可超過三天。
8.生物素標(biāo)記第二抗體孵育
滴加稀釋度合適(按說明書的稀釋度或預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索)的生物素標(biāo)記二抗于切片上,室溫孵育1小時(shí),繼而PBS漂洗3次,每次5分鐘。二抗有抗鼠、抗兔和抗羊等之分,特異性要與一抗匹配,否則,一抗和二抗連接有誤可導(dǎo)致假陰性染色結(jié)果。例如,兔抗鼠或人的一抗需與抗兔的二抗匹配,小鼠抗大鼠或人的一抗需與抗小鼠的二抗匹配。目前,生物素化二抗多以即用型形式存在于SABC或SP免疫組織化學(xué)試劑盒中,故無需考慮其濃度。
9.SABC-POD或SABC-AP孵育
滴加稀釋度合適(按說明書的稀釋度或預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索)的ABC-POD或SABC-AP于切片上,室溫孵育10~30分鐘,隨后PBS漂洗4次,每次5分鐘。SABC或SP試劑盒中的即用型試劑無需稀釋。
10.顯色
顯色是免疫組化染色的zui后關(guān)鍵步驟,一般過氧化物酶的檢測系統(tǒng)選用DAB或AEC顯色。前者顯色為棕色,后者為紅色。要得到*的顯色效果,必須在鏡下嚴(yán)格控制,以檢出物達(dá)到zui強(qiáng)顯色效果而背景五色為終止點(diǎn)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),DAB在配制后zui長放置時(shí)間是30分鐘以內(nèi),過時(shí)則不能使用,DAB滴加到組織切片時(shí)作用時(shí)間zui長不宜超過10分鐘(在5分鐘內(nèi)),否則不管有無陽性結(jié)果均應(yīng)終止反應(yīng)。對一些富含內(nèi)源性酶的組織用DAB顯色時(shí)極易出現(xiàn)背景色,應(yīng)盡早在鏡下控制,以達(dá)到*分辨效果。DAB有致癌作用,故操作時(shí)應(yīng)戴手套,盡量避免與皮膚接觸,用后及時(shí)洗手,接觸DAB的實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)洗液浸泡24小時(shí)后方能再次使用。AEC顯色系統(tǒng)的弊端是易溶于有機(jī)溶劑,所以封片時(shí)應(yīng)以水性封片劑為主,故染色切片不能保存。免疫酶染色時(shí),酶底物濃度的增加或孵百盯面雨延長,均可增強(qiáng)染色強(qiáng)度。過氧化物酶顯色時(shí),H2O2濃度使顯色反應(yīng)過快而致背景加深,且過量H2O2能抑制酶的活性,故H2O2濃度要適中。
如果上述步驟使用鏈霉親和素―生物素―堿性磷酸酶復(fù)合物,則需選用NBT/BCIP作為顯色系統(tǒng).陽性結(jié)果為藍(lán)黑色。顯色后蒸餾水或自來水沖洗。采用堿性磷酸酶作為標(biāo)記物底物時(shí),染色過程中的緩沖液用0.02mol/LTBS(pH 8.2)較好。
11.蘇木精復(fù)染細(xì)胞核
為使組織切片清晰的顯示組織結(jié)構(gòu),便于準(zhǔn)確定位,常對切片進(jìn)行復(fù)染。zui常使用的細(xì)胞核染料為蘇木精,也可根據(jù)情況使用甲基綠和核快紅。染色約10秒,鏡下控制著色程度,效果好時(shí)自來水沖洗返藍(lán)。
12.封片
如果選用DAB顯色,則切片經(jīng)過梯度乙醇脫水(80% 乙醇2分鐘,95%乙醇2分鐘),乙醇Ⅰ和100%Ⅰ乙醇Ⅱ各5分鐘,二甲苯Ⅰ和Ⅱ各透明5分鐘,zui后中性樹脂封固;如果選用AEC顯色,則切片不能經(jīng)乙醇脫水,沖洗后拭干直接用水性封片劑封片。